结核病的实验室诊断.ppt

* 优点： Hain 技术可以快速检测RFP和INH的耐药 时间短、操作简单、安全高 特异性和灵敏度较高、重复性好 主观因素影响小、更为可靠 缺点: 需要专门设备； 未发现所有的耐药突变位点，不能检测所有药物的耐药基因型； MTBDR plus试剂盒的检测试纸条，缺少ahpC-oxyR间隔序列范围，否则可进一步提高INH耐药检测的敏感性； 不能取代传统细菌学检测、只能作为参考。 进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台 此平台由FIND和Cepheid（一个加州公司）所开发 痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理 GeneXpert 设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、 rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变 该系统非常容易使用，不需要进行分子生物学培训 该检测方法另外一个特点是操作完全自动化，使用起来既容易又安全。 ②. Xpert MTB/RIF 设计五个重叠的分子信标，检测81碱基 rpoB核心区域所有可能的突变 用不同的荧光基团标记每个分子信标，使仅在一个反应中完成整个检测成为可能 探针能检测野生型菌株（RIF-敏感人群）；ropB突变造成特定信标的信号丢失 （RIF-耐受人群） 每个探针必须：能检测野生型菌株；不能检测Rif耐药突变菌株，不能检测出非TB分枝杆菌. Xpert MTB/RIF的引物设计 Xpert MTB/RIF Xpert MTB/RIF 与 Hain的比较 ： 只能做TB-DNA和利福平耐药基因； 只能通过8个缺失的野生型信号进行突变检测，不能探检测出现的突变信号； 样本通量少(4个/次）； 所需样本量大（1mL/次）； 仪器断电后只能重新开始； Hain有记忆功能。 维护：刚进入中国市场，故障后只能返厂修理，费用昂贵。 ③. DNA微阵芯片 基本原理：与Southern、Northern是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针固定在玻璃等基片上，然后与待测样品的DNA或RNA互补的靶核苷酸序列杂交，从而获得待测样品的信息 基因芯片的检测过程 结核耐药快速检测基因芯片 * 结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法） 基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药（利福平、异烟肼） 通 量：两种一线抗结核药物、8个突变位点 速 度：6小时versus 传统 4~8 周 灵敏度： 103 CFU/反应 特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读 利福平耐药 利福平敏感 结核耐药检测基因芯片 软件判读 激光共焦扫描仪 样品制备仪 杂交仪 发表文章：The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 2009, 13(7): 914–920. 发明专利：申请号： 200810105172.X。授权公告号：CN 101285062 B。 1.晶芯?分枝杆菌核酸检测试剂盒 2.晶芯?十七种分枝杆菌菌种鉴定试剂盒 3.晶芯?分枝杆菌耐药检测试剂盒 4.晶芯?九项遗传性耳聋基因检测试剂盒 DNA微阵芯片 ④.探针熔解曲线技术 检测结果判断 Sputum 涂片 培养—孵育8周 （阳性） 药敏试验—观察 孵 育4周观察生长情况 涂片/TB-DNA/ TB-RNA （阳性） 分子诊断/药敏技术 液体培养及药敏试验 平均时间2-3个月 平均时间20天 只需1-2天 小 结 感 谢 聆 听！ * * 通过文献检索，近四年有关结核病诊断方法的研究中，IGRA约占到40%，培养、血清学等传统诊断方法站到近20%的比例，在新型诊断方法研究中，结核病分子标识的研究越来越受到重视。 * * MGIT960 320 * * * * * * 结果斑点数量的多寡； * 结果斑点数量的多寡； * 结果斑点数量的多寡； * * * * * * T-SPOT?.TB临床性能指标 特异性 只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床数据：特异性94.1%(478/508) 灵敏度 基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率 美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655) 灵 敏 度 Reference Sensitivity Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53 100.0% (12/12) Ferr