脉冲场凝胶电泳试验流程.pdfVIP

脉冲场凝胶电泳实验流程 一、 准备样品 1. 琼脂糖包埋的样品 常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA 。大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易 因移液等操作造成机械剪切。将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大 分子量DNA 的断裂。琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。处理 过的包埋有DNA 的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。 在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。单位吸光 度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。这会影响琼脂糖块中DNA 的含量，导致上 样量过大或不足。不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的 细胞浓度。 Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713 ）。每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm 的琼 脂糖胶块。样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需 要修剪就可直接放入点样孔。 2. 液体样品 小于200kb 的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。当操作的DNA大 于50kb时，必须用大开口的吸头。如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm 的梳子可以获得更锐利 的条带和更高的分辨率。 3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA 该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591 ）。 1) 将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。用血球计数板对细胞计数，每毫 7 升琼脂糖块需要5 x 10 个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm 的样品块需要0.1 mL琼脂糖。 2) 准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594 ），用微波炉融化并置于50 °C水浴。 3) 1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl, 50 mM EDTA ）重悬细胞并置于50 °C水浴。 4) 将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 °C水浴，用移液器将混合 物加入样品模具。静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 °C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固 并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。 5) 使用50 mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% sodium deoxycholate, 1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/mL Proteinase K ）。将凝固的琼脂糖块从 模具中捅入盛有蛋白酶K反应液的50 mL离心管中。于50 °C水浴中消化过夜，不需要振荡。 注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA 。 6) 用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA ）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡， 每次30-60 min 。如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2 、3次洗涤时加入1 mM PMSF使残余的蛋白酶K失活。 7) 琼脂糖块可于4 °C保存3个月至1年。 8) 琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。请在酶 切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE