课件：《植物病毒》PPT课件.ppt

Pinwheels, Scolls and Laminated Aggregates Potyvirus Cylindrical Inclusions Pinwheels, Scolls, and short Curved Laminated Aggregates 采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态 Orf virus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎) Ebola virus埃博拉病毒（正染技术） Vaccinia virus 痘苗病毒 （投影技术） 负染技术 免疫学方法 在病毒检测中应用最广泛的有： ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 优点：具免疫荧光法和放射免疫法的反应灵敏、特异性强的优点、克服常规血清学方法中受病毒浓度、粒子形态和抗血清用量等缺陷。 方法：间接法、双抗体法、双夹心法、竞争法 应用：ELISA反应快速便利，适合于大规模田间样本的常规病毒检测，也广泛用于脱毒植物、无性繁殖的苗木以及种子上的病毒检测。 酶联免疫吸附试验（ELISA） 间接法 双抗体夹心法 竞争法 直接法 双夹心法 非标记抗体酶法 原 理： 酶标抗体 抗原 酶标抗原抗体复合物 底物 产物 显色剂 比色测定 酶促反应 将酶标记的抗原或抗体吸附到适当的载体上进行抗原—抗体反应及酶催化反应。 免疫学方法 在病毒检测中应用最广泛的有： 免疫扩散（单向与双向） 用于比较同源、异源抗原，可区别病毒不同种和不同株系。 斑点免疫结合测定法（DIBA） 以硝酸纤维薄膜为载体进行酶联免疫吸附测定。 硝酸纤维膜比酶联板便宜而且携带方便，进行田间病害诊断时，可直接用病毒粗汁液进行大量样本的测定。 比ELISA简单，实验流程短，不需任何特殊设备，而且灵敏度高。 抗原/抗体吸附在NC膜上，通过与相应的抗体/抗原和酶标记物反应形成酶标记的抗原-抗体复合物，加入相应底物后显色，呈现肉眼可见的颜色斑点，根据颜色有无和深浅判定。 免疫学方法 免疫扩散 用于比较同源、异源抗原，可区别病毒不同种和不同株系 有共同抗原，但不完全相同 不同抗原 免疫学方法 在病毒检测中应用最广泛的有： 组织印迹法 在ELISA的基础上发展起来的植物病毒检测技术 保持ELISA对病毒检测的灵敏度高、特异性强的特点，而且大大地简化了操作程序，对病毒的检测更加快速、简单、方便。 印迹在硝酸纤维膜上的样品能保存3个月以上，检测结果能直观地显示出病毒感染的部位。 尤其适用于植物病毒的大规模普查，是近年来国外对植物病毒检测广泛采用的技术。 植物病毒的检测——组织印迹法 1、基本原理 与间接ELISA相同，首先将待测样品印迹在固相载体——NC上，用病毒的家兔特异性抗体(Ig)与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与碱式磷酸酶(Alkaline phosphatase AP)标记的第二抗体（羊抗兔Fc）进行反应，最后用碱式磷酸酶的反应底物BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/ nitro blue tetrazolium)进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。 植物病毒的检测——组织印迹法 具体反应： 碱式磷酸酶（AP）以硝基酚磷酸盐为底物，在pH9.5条件下产生不溶性蓝色。 (辣根过氧化物酶HRP是以H2O2为底物,需要供氢体如四甲基联苯胺(TMB)参与，在pH5.0条件下产生可溶性黄色产物，需借助比色分析.) 植物病毒的检测——组织印迹法 植物病毒的检测——组织印迹法 基本步骤 1、采样 3、封闭 2、点样 4、洗涤 5、病毒与特异抗体反应 6、洗涤 7、第二抗体连接反应 8、洗涤 9、显色反应 10、终止显色 11、干燥保存 采取植物叶、茎根等，避免手与样品伤口接触，装入塑料袋。 将NC膜 置于平整洁净滤纸上，用手术刀片横切样品，将切口均匀压印在膜上，印迹清晰为宜，每张膜上可排列数百个样品，设正负对照。 将点好样的膜置于盛有2％脱脂奶粉的PBS封闭液的培养皿中，封闭液的用量以覆盖膜为宜．在37℃下温浴 lh或 4 ℃过夜 用PBS-Tbuffer洗膜3次，5min/次 将清洗后的膜转入含有特异性抗体的封闭液或PBS缓冲液的培养皿中，37℃下温育3h或4℃过夜 7 洗毕，将膜转入含碱式磷酸酶标记的羊抗兔第二抗体的PBS缓冲液中，37℃下温育3h或4℃过夜 9 将NC膜 转入显色液中直至阳性对照显色为止（5~10min） 10 待阳性对照显示清晰的紫蓝色时，将膜转入蒸馏水中．终止反应 终止反应后．将膜放置于干净的卫生纸之间，使之干燥，待完全干燥后过塑，便永久保存和观察 植物病毒的检测——组织印迹法的灵敏度 一次切割，连印45次（蕙兰花叶病毒） 感病叶汁液稀释1：100