酵母双杂实验原理及技术.pdfVIP

蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和 DNA 上特异的序列 结合而启动相应基因的转录反应。这种 DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两 个相互独立的结构域即 DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母 双杂交实验采用的系统有 LexA 系统和 Gal4 系统两种。在 LexA 系统中，DNA 结合结构域 由一个完整的原核蛋白 LexA 构成，转录活化结构域则由一个 88 个氨基酸的酸性的大肠杆 菌多肽 B42 构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4 系统中，BD 和 AD 分别由 Gal4 蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与 768-881aa)构成。在利用 GAL4 系统筛选 cDNA 文库或 研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列 （GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与 GAL UAS 结合，只有当 BD 与 AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与 AD 才能与 GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在 BD 与 AD 要导入的酵母菌 AH109 中，通过基 因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了 3 个报道基因——ADE2 ，HIS3 ，MEL1 （或LacZ ）， 因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是 否存在相互作用。GAL4 系统的原理如图所示： GAL4 BD GAL4 AD bait cDNA pGBKT7 pACT2 Kanr Ampr Trp1 Leu2 pGBKT7-bait pACT2-cDNA AH109 （Trp,Leu,His,Ade 表达缺陷株） GAL4 AD Bait protein cDNA:protein GAL4 DNA-BD UAS Promoter Mel/Ade/His/LacZ reporter gene 图一：酵母双杂交系统工作原理 1 2 ．系统特点 同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优 势。首先，融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的 折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此较 之后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。其次，双杂交系统的敏 感度即高，可以检测到在蛋白质之间结合常数低至 1mmol/L 左右的微弱作用。许多微弱或 短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合 蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。第三，在筛选 cDNA 文库时，双杂 交系统