血浆、血小板和红细胞分离.doc

请问如何在同一血液中分离血浆、血小板、红细胞？ 洗涤法以5%EDTA抗凝的血样在室温下，以1500rpm/ 200g离心12分钟，离心后上层为富血小板血浆，下层为压积白细胞和红细胞。将富血小板血浆转入塑料试管，3500rpm/1200g离心5min。弃去上层血浆，用血小板洗涤液洗涤3次。梯度密度离心法梯度密度离心法常用的分离液有Ficoll、Fercoll、戊糖等，Ficoll是最适合于分离细胞的分离液。Ficoll主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。分离时先将分层液置试管底层，然后将抗凝全血以PBS稀释叠加在分层液上面，水平式离心后，血小板因密度小而悬浮于上层，将上层液体吸出，用血小板洗涤液洗涤3次便可得到纯化血小板。凝胶过滤凝胶过滤，又称凝胶色谱、凝胶层析。该技术是建立在分子筛概念的基础上的。一般常用的材料有葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等。血小板纯化常用的是牛血清琼脂糖凝胶。该凝胶是一种交联的聚合物，具有网络结构。将分离出来的富血小板血浆铺加于凝胶表面。离心使其在凝胶柱中流滤。血小板只能沿凝胶颗粒间的空隙随溶剂流动，不能进入凝胶颗粒内部，故租滞作用小，流程短，流动速度快而先流出凝胶柱。血浆蛋白则渗入凝胶颗粒网内，故租滞作用大，移动速度慢而较迟流出凝胶柱，从而达到纯化血小板的目的。方法比较与评价早期的血小板分离技术主要是根据血小板的物理属性如密度等进行分离的，用目前的标准看，其分离的灵敏度及分辨率都不高，以离心为主要手段的分离方法仅能除去70%-95%的白细胞，且血小板损失量较大，一般血小板回收率为70%。而且，上述方法分离的血小板仍然存在一定量的血浆蛋白，当进行荧光分析或其它分析时，血浆蛋白的存在对实验产生一定的干扰作用。另外，Bogdan Walkowiak等人用流式法对经上述三种方法分离的血小板表面P选择素的表达进行检测，发现经上述方法分离的血小板P选择素的表达量与全血中血小板的表达量相比，均有不同程度的增加。洗涤法与梯度密度离心法分离的血小板的表达量是全血中的2倍多。结果表明，上述方法分离血小板过程对血小板存在影响，使部分血小板在分离过程中活化了。活化的血小板可以影响以后的实验信息数据，甚至改变结果。由此可见，早期的分离方法存在着若干不可避免的问题。但是，由于上述方法简便易行，不需要繁复的设备仪器，使其至今在众多实验室内仍然被广泛应用着。如果仅作为初步血小板分选或血小板富集的手段来说，上述技术方法还是十分有效的。近期发展起来的先进分离技术免疫磁珠分选技术免疫磁珠分选技术（MACS）是高效简捷的血小板分离纯化方法。MACS是利用血小板表面标志CD61进行分离的。将单克隆抗CD61-PE包被在磁珠上，然后包被上单克隆抗体的磁珠与血小板特异性结合。磁珠携带着与之结合的血小板吸附于分离柱上，没有与磁珠结合的阴性细胞流出，从而实现了血小板的分离。用MACS细胞分选系统可以分离出非常纯的血小板，纯度可以达到80%-99%，连续两次过柱分选可进一步提高血小板纯度，通常可大达95%-99%，回收率在90%以上。而且，由于微型磁珠的体积极小，其直径只有50nm，所以不会对血小板造成机械性压力，而且使孵育时间短，操作过程快。MicroBeads形成一个稳定的胶体液，它们在磁场中既不沉淀又不凝聚。微型磁珠的大和它的组成成分（氧化铁和多糖）使其可被生物降解，且不会激活细胞或影响细胞的功能和活力，细胞的生理功能也不会改变。磁珠不需要去除，因此，阳性分选出的细胞可立即用于分析和随后的实验。如果操作得当，其分离效果与流式细胞术的血小板分离效果基本处于同一水平，并还具有比流式细胞仪的分离更省时，费用低，及操作简单等优势。流式细胞术流式细胞分选技术是目前最先进的分离纯化技术之一。血液中的血小板在激光束的照射下发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，经计算机处理，被确认为CD61阳性细胞，超声压电晶体通电后发生高频震动，使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴，每秒钟形成液滴上万个，每个液滴包含着一个样品细胞。CD61阳性的血小板被充电，在通过偏转的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定的容器中。阴性细胞不发生偏转进入中间废液收集器中，从而实现了分选。流式细胞仪分离细胞速度大概为4500000个每小时，经分选可获得高纯度、高回收率及高活细胞率，所分离的血小板仍然可保持无菌、原有结构和生物活性。上述特点决定流式细胞术分离血小板无疑可获得最佳效果。但该方法的限制性，首先在于费用昂贵，需要流式细胞仪这样的特殊设备，其次所需时间相对较长，如加大压力和流速，则造成了细胞的损失，因此，人们常常在流式细胞分选血小板前，作其分离的预分离，分离出富血小板血浆，以提高血小板在样本中所占的比例，从而可以