流式配色与分析.pptVIP

选择BD Fixable Viability Stain Reagents（FVS染料）： 荧光补偿： 所谓“补偿”就是除去某一荧光素误入到其它荧光通道中的发射光信号。通过调节仪器完成这一步骤。往往我们通过检测带有单一荧光素的样本来减除误入其他荧光通道的信号。既单阳管。 三、单阳管：带有单一荧光抗体的样本管 用来排除荧光补偿 **注意，实验用到几种荧光，就要制备几种单阳管** 完整的流式实验方案 完整的流式实验方案包括： 空白对照管：去除自发荧光 同型对照管：去除非特异性荧光 单阳补偿管：去除荧光泄漏 实验样本管：检测样本 阴性对照与阳性对照 通过设置阴性对照和阳性对照更好的界定实验组的样本表达情况； 流式上机时的仪器条件设置 阈值设定 光电倍增管电压设定 补偿调节 门与设门 阈值设定 流式细胞分析的对象主要是细胞和微球，但实际上细胞碎片，颗粒性杂质也会被检测到。通过设定阈值可以减少后者的干扰； 每个通道阈值都可以设定。通常选择FSC通道进行阈值的设定，特定情况下会同时/或设定其他通道的阈值； 通常使用空白对照调整阈值； 电压设定 每一个流式通道都有自己特定的光电倍增管，其电压独立调控，在初次上机时一定都要调节到位，例如行fitc/pe双染，需调节fsc，ssc，fitc，pe4个通道的各自电压； 通常使用空白对照进行设定 电压偏低 电压合适 电压偏高 在行多色实验时，电压应该尽可能的合适甚至是稍微偏低，否则会影响到补偿调节； 电压必须先于补偿调节，改变电压补偿亦会随之改变； 补偿设定 通常使用单阳管进行设定 光谱重叠会导致不同荧光通道间干扰，通过补偿调节将干扰信号减去，从而保证流式分析结果的正确； 调节补偿是按照“被减原则”进行； Relative Intensity 650 nm 700 nm 500 nm 550 nm 600 nm W a v e l e n g t h ( n m ) Detector - % Signal FITC Compensation FL1 530/30 FL2 585/42 FITC Compensation 24.8% of the Signal Sensed in FL2 650 nm 700 nm 500 nm 550 nm 600 nm Relative Intensity W a v e l e n g t h ( n m ) F i g u r e C FL1 530/30 FL2 585/42 650 nm 700 nm 500 nm 600 nm Relative Intensity W a v e l e n g t h ( n m ) 550 nm PE Compensation FL3 650 and Higher FL1 530/30 FL2 585/42 同一样本，调节荧光补偿前后的变化： 当实验样本珍贵/表达低时，可以选择补偿调节微球代理样本进行仪器调节： BD CompBeads系列： 产品编号 产品名称 包装规格 品牌 552844 Anti-rat Ig,k 6ml BD 552843 Anti-mouse Ig,k 6ml BD 552845 Anti-rat/hamster Ig,k 6ml BD 本身不携带荧光的微球，与荧光抗体特异性结合来调节补偿 可以用于胞内/核内染色，一起被固定破膜； 可以用于多色分析和复合荧光素补偿调节； 灵敏度高，和抗原保持一致性好； 门与设门 什么是门？ 在细胞分布图中圈取/界定某一个范围或某一细胞性状的细胞群，从而进一步对其进行单/多参数分析。门的形状可以是任意形状（线性，X形，象限） 门与设门 对于细胞群复杂，不易区分的情况下，有时候我们可以使用反向设门； 多色实验中通常会进行组合设门，将不同参数进行结合，最终通过层叠逻辑性设门得出想要分析的相关参数： 特邀专家： BD IS部门 资深工程师 曾令武老师 BD PMG部门 资深工程师 郝晋 博士 BD PMG部门 高级工程师 马红 博士 优宁维 PMG部门 资深技术支持 胡冰 坚持为大家提供： 专业的方案指标选择； 专业的流式多色配色； 专业的实验技术指导； 专业的实验结果分析； 优宁维BD伴您实验无忧！ 上海优宁维生物科技股份有限公司 罗立博 联系方式QQ：1183341237 抗体选择，染料之间补偿值尽量小，检测抗原达到最佳 * Data maybe added from Maria’s data sets – See CD3 single color to show positive / negative; Some antigen like CD45RA t