油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测BJS201907.DOC

——PAGE \* MERGEFORMAT2— —PAGE \* MERGEFORMAT1—— 鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测 BJS 201907 范围 本方法规定了鳕鱼及其制品中裸盖鱼（Anoplopoma fimbria）、油鱼（Lepidocybium flavobrunneum，Ruvettus pretiosus）和南极犬牙鱼（Dissostichus eleginoides，Dissostichus mawsoni）源性成分的实时荧光PCR检测方法。 本方法适用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品（不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品）中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。 原理 使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼特异性引物探针，通过实时荧光PCR反应，获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。 试剂和材料 除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T 6682的一级水要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 3.1引物探针序列 3.1.1裸盖鱼源性成分NADH2基因 裸盖鱼源成分5 ’端引物：5 ’-AGGGACCACCCTAACATTCG-3 ’ 裸盖鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-3 ’ 裸盖鱼源性成分探针：5 ’-FAM-CAGCTCTCACTGACTACTCGCATGA-BHQ1-3 ’ 3.1.2油鱼源性成分Cytb基因 油鱼源性成分5 ’端引物：5 ’-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3 ’ 油鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3 ’ 油鱼源性成分探针：5 ’-FAM-CATCCGAAACCTTCATGCAAACGGC-BHQ1-3 ’ 3.1.3 南极犬牙鱼源性成分CK基因 南极犬牙鱼源性成分5 ’端引物：5 ’-CTGAATATGTAGGTGCATACG-3 ’ 南极犬牙鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3 ’ 南极犬牙鱼源性成分探针：5 ’-FAM-TCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ1-3 ’ 3.1.4内参照基因真核生物18SrRNA 内参照5 ’端引物：5 ’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3 ’ 内参照3 ’端引物：5 ’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3 ’ 内参照探针：5 ’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BHQ1-3 ’ 3.2 商业化DNA提取试剂盒。 3.3 商业化PCR反应预混液。 仪器和设备 4.1实时荧光PCR仪。 4.2微量紫外分光光度计。 4.3恒温水浴锅。 4.4高速冷冻离心机：离心力18,000 g以上。 4.5微量移液器（0.5 μL- 10 μL，10 μL- 100 μL，20 μL- 200 μL，100 μL- 1000 μL）。 4.6 涡旋振荡器。 4.7 天平：感量0.001 g。 分析步骤 5.1 样品前处理 （1）样品只有单块鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。 （2）样品有五块以下鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。 （3）样品有五块以上鱼肉组成：随机挑选5块鱼肉，使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。 将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液，尽可能剪碎并混匀。 注：速冻鳕鱼产品应在完全解冻后再取样。 5.2 DNA提取 按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，每个样品设置两个平行，按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。 5.3 DNA浓度测定 取1 μL DNA溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDNA（双链DNA）计算方式检测其浓度。 5.4 实时荧光PCR扩增 实时荧光PCR反应体系见表1。 表1 实时荧光PCR反应体系 PCR预混液（2 ×） 10 μL 10 μmol/L上游引物 0.4 μL 10 μmol/L下游引物 0.4 μL 10 μmol/L 探针 0.2 μL DNA 20-50 ng 灭菌去离子水 补充至总体积20 μL PCR反应程序：95 ℃ 15 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s（读取荧光），40个循环。 5.5 实验对照 分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。 阳性对照：含相应物种的DNA。 阴性对照：不含相应物种的DNA。 PCR空白对照：以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR反应体