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GM试验培训课件 市场部 2014年8月 GM试验培训课件 市场部 曲霉菌简介及曲霉菌感染现状 GM试验的检测原理 GM试验的检测步骤 GM试验的注意事项及影响因素 4 GM试验与G试验的联合检测 5 6 GM试验适用的科室 1 3 2 Lin SJ, et al. J Clin Infect Dis, 2001, 32(3): 358-366 烟曲霉 黄曲霉 黑曲霉 定义：曲霉菌(Aspergillus)是广泛存在于自然界一种腐生菌，孢子较小直径2-3um，可在空气中漂浮，可通过呼吸道进入人体。 多种曲霉菌都可引起侵袭性曲霉病，如烟曲霉、黑曲霉、土曲霉、黄曲霉和构巢曲霉等。 一、曲霉菌简介 （一）曲霉菌感染现状 曲霉感染不容忽视 Tortorano AM et al. Mycoses. 2011, 55: 73–79. 38个 ICUs of 27个意大利医院 384 例真菌感染 (318例侵袭性念珠菌感染；63例霉菌感染；3例隐球菌感染) 曲霉感染 57例 毛霉菌感染 4例 镰刀菌感染 1例 木霉菌感染 1例 霉菌感染的比例为16% （二）曲霉菌感染现状曲霉感染死亡率高 死亡率(%) 全因死亡率 归因死亡率(曲霉) 时间(周) 二ＧＭ的检测原理 ELISA方法简介 酶联免疫吸附测定技术(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 是以抗原、抗体的特异性结合反应为基础，将抗原或抗体的检测与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的免疫检测技术。 曲霉菌抗原检测采用了间接竞争法。 ELISA试验操作过程由样本处理、加样、孵育、洗涤、显色、终止等几个基本环节组成。 　 （一）ＧＭ的检测原理 检测物质 本实验检测曲霉菌中的半乳甘露聚糖。 半乳甘露聚糖（Galactomannan，简写GM）是曲霉菌细胞壁上特有的成分，当菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原。 当曲霉在深部组织中生长时，半乳甘露聚糖可释放入血液，因此检测病人血液或者是体液中的半乳糖甘露聚糖可以作为早期诊断感染的方法。 （一）ＧＭ的检测原理 实验原理 本实验使用特异抗体检测曲霉菌半乳甘露聚糖抗原。其原理是标本中的抗原和包被的固相抗原均与试剂中抗体竞争结合。标本中抗原量含量愈多，与试剂中抗体结合越多，结合到固相上的酶标抗体愈少，最后的显色也愈浅。 标本和试剂反应后所产生的颜色变化（OD值）与标本中待测定的GM含量成反比关系。 通过标准曲线，便可以通过反应显色的OD值计算出待测标本中GM的含量。 （一）ＧＭ的检测原理 三实验操作流程 GM实验所需的仪器及耗材 1. 酶标仪：必须能使用450nm波长用于检测。 2. 高速离心机：必须达到10000g离心力以上，最好是低温离心机。 3. 37℃恒温培养箱（或其他可替代的恒温空气浴设备）必须设置温度为37℃，其他温度（如35℃）不可以使用，否则会影响检测值，同时要保证恒温箱的洁净。 4. 沸水浴：一般的电磁炉或者其他可以保证沸水浴的设备皆可，但暂不推荐干浴 5.漩涡混合仪 6. 100μL和300μL多道移液器（排枪）及配套吸头：可以减少不同孔的加样时间差。如果使用洗板机，无需用300μL多道移液器。 7. 100μL和1000μL单道移液器及配套吸头 8.配制洗液的量筒和保存洗液的试剂瓶 9.封板膜：需用户根据每盒试剂做实验次数自备一部分备用 10.浮漂：沸水浴使用 （一）试剂盒组成 试剂盒组成： 酶标板 标准品 半乳甘露聚糖抗体 半乳甘露聚糖抗体稀释液 酶标抗体 酶标抗体稀释液 底物溶液 终止液 封板膜 存储条件：2-8℃冷藏保存 试剂规格：96人份/盒 （一）试剂盒组成 （二）GM实验操作流程图 孵育 加酶标抗体 加50μL终止液并读数 37℃,40min 37℃,20min 洗板后加100μL 酶标抗体 37℃,60min 样本检测 各取50μL样本和半乳甘露聚糖抗体加入酶标板中 预处理 混匀，100℃水浴3min 待测样本 (300μL) 样本处理液 (100μL) + 4℃，10000g离心10min 取上清检测 显色 终止 洗板后加100μL 显色液 样本处理 1.向离心管中加入300μl待测血清。 2.向离心管中加入l00μl样本处理液R5。 3.漩涡震荡10s以彻底混匀，将离心管放入水浴锅100℃加热3min。 4.将离心管从水浴锅内取出，小心放入离心机内 ，10000r离心10min。 5.取上清液50μl用于检测。 （三）GM实验操作流程 取300μL血清 100μL处理液 + 样本处理示意图 沸水浴3min