基因工程研究策略和实践.pptVIP

基因工程研究策略和实践;基因决定性状;定向改造基因的设想;基因工程的概念;基因工程过程示意图;基因工程的研究策略;一、目的基因的分离;mRNA ;cDNA文库仅包含正在表达的基因 不同物种、不同组织的cDNA文库不相同 基因总量少，易筛选;组织或细胞染色体DNA;包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况 ;3、PCR扩增目的基因片段 适用于克隆序列清楚的基因 以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法;4. 化学合成法获取较短的目的基因;二、载体DNA;载体的选择标准;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;穿梭载体(shuttIe vector) 又称双功能载体(bifunctional vector)。能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体。其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效 率。如pKSV一10、pJDB219载体等。;载体的分类 - 按来源分;1. 质粒载体: (1)分子量较小，在细菌中有较多的拷贝数。 (2)松驰型。 (3)具有一个以上的标志，便于筛选。 (4)具有数个或一个单一的酶切点。 天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是pBR322 ,pUC19.，;常用的质粒载体;2．病毒载体 （1）整合型载体：外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。 （2）游离型载体：能够以病毒颗粒的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如：腺病毒。 ;3.λ噬菌体载体 现用的λ噬菌体载体都是在野生型基础上改造而成的。改建之后的常用载体有两类： ①插入型载体，具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，只能插入较小的外源DNA片段(＜10kb)。如λgt10、λgt11； ②替换型载体，具有成对的克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段可被外源插入的DNA片段取代，能插入较大的外源DNA片段(20-24kb左右)。如charon4、charon10。;4. Cosmid质粒 由λDNA cos区与质粒重组建造而成。在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。 分子量小（约4—6kb），可容纳大至40-50kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因文库。 如 cosmid pHC79 ;三、体外DNA重组;限制性内切酶 ―“分子剪刀”;;DNA连接酶―“分子针线”;1. 粘末端连接 （a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体易自身环化。 用碱性磷酸酶(能除掉DNA-5’端P基团，使5’端带一OH)处理载体，可防止载体自身环化。 （b）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆);Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点的连接;2. 平齐末端连接 优点：可连接任何一对DNA 可恢复一个酶切位点或产生一个新酶 切位点 缺点：连接率低 　　　要求连接酶及底物浓度高; 3. 同聚物核苷酸末端法 在DNA或RNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。 应用末端转移酶在DNA片段3′末端制备粘末端。 避免自身环化 互补序列较长时（4bp)，不需连接酶; ?????????????????????????????????????????????????????????????????? ;4. T-A克隆;受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) ;1. 基本概念 转化（transformation）：把以质粒为载体构建的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程。 转染（transfection）：以噬菌体或病毒构建的重组D