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第四章 基因工程原理——基因工程的基本工具Gene Engineering 定 义 基因工程：对生物体遗传信息的基本单元——基因进行人工改造、干预和定向转移，其技术特征是将不同种类生物的基因或同种生物体的不同基因按照人们的意愿在体外进行拼接重组和变异，通过载体-宿主系统转入另一种生物体内，使之能按照人们的意愿稳定遗传、复制和表达，实现按照人们的意愿，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状的目的。 基因工程基础——核酸 /programs/view/vpwPwCuNtgU/ 基因工程药物的生产过程 基因工程在生物工艺中的应用 筛选和鉴定具有重要生理功能或重要用途的目的基因； 筛选、修饰和重组构建基因表达的转录调控元件和蛋白质生物合成的翻译调控元件； 通过目的基因与载体分子重组，利用载体分子的扩增提高目的基因在受体细胞中的剂量来提高表达水平； 工程菌的稳定增殖和目的基因的稳定表达； 基因表达产物的后处理等； 基因工程的基本形式 基因工程的主要操作步骤 /u70/v_NDg4ODQ0OTk.html A 用于核酸操作的工具酶 ②识别序列一般是回文序列 Eco RI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ③简并识别序列 ?有些酶的识别序列不是一个，而是多个。 ?在基因重组时要尽量少用这些酶 2、特点 ①识别位点与酶切位点高度一致，具有高度特异性。 ②极为稳定 ③辅酶：Mg++ 5、酶切位点 II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或附近，产生以下4种情况。 ①5’粘性末端；②3’粘性末端；③平末端和④非互补的粘性末端 ?无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内切酶，所留下的残端都是一样的。 ?经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是保留一个OH 大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75Ku的多肽链。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。 噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60Ku，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。 另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。 应用： 3突出末端平滑化（1，2） 5突出末端补平（3） 单链删除后亚克隆（3） 基因定位突变中的第二条链的合成（4） 通过置换合成法（replacement synthesis）对DNA探针进行标记。 DNA聚合酶(DNA polymerase) 基因工程中常用的工具酶 DNaseI 1.特点： ①具内切酶活性，作用于双链DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸; Ca2+, Mg 2+或Ca2+, Mn2+可使酶活达最大值 ②当酶浓度很低时，双链DNA分子上将形成切口 ③Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关 ④Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 2. 用途： ①切口移位，制备DNA探针 ②制备RNA样品时除去DNA分子 ③基因突变时产生切口 TaqDNA聚合酶 1. 特点： ?分离自水生耐热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性 2. 用途： ?主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4×106倍。 RNA聚合酶 特点： 依赖于DNA的RNA聚合酶，具SP6启动子特异型 用途： 主要用于RNA分子的体外合成，RNA分子可用于： ①RNA分子的拼接研究 ②标记的RNA常用于杂交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标记，产生的RNA具高放射比活性 ③DNA的定序分析 ④基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置 ⑤还可以用于蛋白质的合成研究 其它酶类 1.原生质体的制备酶类 制备原生质体目的：外源DNA导入；核酸和蛋白质的提取 溶菌酶，zymolyase，glusulase，NovoZyme，溶壁酶，纤维素酶 2.蛋白质降解酶类 蛋白酶K 3.检测酶类 抗生蛋白链素β-半乳糖苷酶, 碱性磷酸酶, 辣根过氧化物酶 p60 B 用于基因克隆的载体 pBR322 质粒载体pB