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双萤光素酶报告基因的应用，常见载体及案例简介双萤光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Reporter Assay）通常以萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)为报告基因，以海肾萤光素酶(Renilla luciferase)为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。Firefly luciferase（简称F-Luc）以萤光素(luciferin)为底物，在Mg2+、ATP和氧分子存在条件下，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在此过程中发出最强波长在560nm左右的生物萤光(bioluminescence)。F-Luc表达框的上游启动子区域插不同功能序列，可以通过转录起始条件造成其报告萤光的变化。在F-Luc的3’UTR区域插入待验证的靶序列，通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低，可以反映是否存在靶向互作。Renilla luciferase（简称R-Luc）以腔肠素（coelenterazine）为底物，在氧分子存在的条件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，此过程中发出最强波长在465nm左右的生物萤光。R-Luc通常由固定组成型启动子驱动，在报告系统中作为校正input误差的内参信号。生物萤光产生反应式一、应用方向1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素活性。3. 启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。4. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。5. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。6. 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。例如，在GPCR研究中，将cAMP response element（CRE）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。又如，将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。二、常用萤光素酶报告基因载体pGL3-BasicpRL-TKpmirGLO三、经典案例案例一题目：Long non-coding RNA linc00673 regulatednon-small cell lung cancer proliferation,migration, invasion and epithelialmesenchymal transition by spongingmiR-150-5p期刊：Molecular Cancer小结：验证linc00673具有miR-150-5p的靶向结合位点。将linc00673包括预测结合位点的序列克隆到pmirGLO- linc00673-WT，同时构建靶位点突变的pmirGLO- linc00673-MUT，分别共转miR-150-5p mimics及NC mimics，结果显示miR-150-5p转染组的相对荧光值降低，提示存在靶向结合。图：RNA与质粒共转染293T，24h后双萤光素酶检测案例二题目：SOX9 indirectly regulates CEACAM1 expression and immuneresistance in melanoma cells期刊：Oncotarget小结：验证SOX9对于CEACAM1的转录调控作用。分别使用了两种黑色素瘤细胞526mel和624mel，对CEACAM1的启动子区域分别选择了600bp-200bp的截短片段，共转染过表达SOX9，显示SOX9能够抑制CEACAM1启动子的转录。图：截短的pCEACAM1进行双萤光素酶检测