第六章--放射免疫实验.ppt

第三章 放射免疫分析技术 体外放射分析技术 利用放射分析方法或其派生的相关技术在体外进行体内物质种类和含量的分析测定。 第三章 放射免疫分析 放射免疫分析的创立 1959 美国Yalow Berson 1960 英国 Ekim’s 1977 获诺贝尔医学生物学奖 放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA） 1959年，Yalow和Berson创立了放射免疫分析法（RIA），并因此于1977年获得诺贝尔生物医学奖。 这种方法结合了放射性核素测量的高灵敏性和免疫抗原-抗体反应的高特异性两大特点，开创了生物活性物质微量测定技术的先河。 基本原理 Ag + Ab Ag-Ab + Ag* Ag*-Ab 标准曲线 标准曲线又称为剂量反应曲线，以一系列递增浓度的Ag及一定量的Ag*与恒定量限量的Ab竞争结合反应而得，是对待测物进行定量分析的基础。 标准曲线实例 放免分析基本条件 （一）标准抗原 （二）特异性抗体 （三）标记抗原 （四）分离技术 （一）标准抗原 a. 概念：是指已知真实含量，且不含对免疫反应产生干扰杂志的抗原。 b. 用途： 免疫动物制备抗体——Ab 放射性核素标记——Ag* 绘制剂量反应曲线 c. 要求： 高纯度 高准确度 良好的稳定性 （二）特异性抗体 a. 对特异性结合抗体的要求： 1．亲和力 （affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力，用 亲和常数Ka 值表示，反映灵敏度，Ka应达109~1012mol/L。 2．特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的结合能力（交叉反应率）低。 3．滴度 （效价）高：指将血清稀释时能与抗原发生反应的最高稀释度。它反映抗血清中有效抗体的浓度。稀释倍数越高，滴度(titer)越高，表示抗体的效价越高。 4．稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定。 b. 抗血清的制备： 1.大分子物质可直接免疫动物诱导抗体产生，但是小分子物质为半抗原，必须与载体结合制成人工抗原（半抗原-蛋白质），才能进行免疫。 2．选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊。 3．应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油 +卡介苗）。 4．选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数。 c.单克隆抗体的使用： 特异性高 亲和力低，不一定优于传统的多克隆抗体 对标记抗原的要求： 1．放射性比活度高：即单位物质的放射性强度高，一般至少达到370GBq/mmol。 2．免疫活性：与标记前一致。 3．放射化学纯度高：应 95%。 4．稳定性好：标记的同位素不易脱落。 常用标记核素： （1）125I： γ 射线，半衰期 60 天 （2）3H： β 射线，半衰期 12.3 年 测量仪器： （1）γ 计数仪 （2）β液体闪烁计数器 两种标记方法的优缺点 3H标记物 125I 标记物 货架期长 货架期短 以3H置换H，对原物质 以125I取代H，可能影响 免疫活性无改变 免疫活性 标记难度大，比活度低 标记方法简单，比活度高 Β射线测量效率低 γ射线测量效率高 废弃物处理较困难 废弃物处理较容易 a. 对分离方法的要求： 1．使抗原-抗体复合物（B）与游离抗原（F）尽可能分离完全； 2．分离后便于放射性测量； 3．分离效果不受外界干扰因素的影响； 4． 操作简便、分离迅速、重复性好； 5．与游离标记物的非特异性结合尽可能小； 6. 试剂来源广泛、价格低廉。 b. 常用的分离方法 1. 双抗体法 特点： 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但分离时间长，成本高。 2. 沉淀法 聚乙二醇（w=6000） 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 3. 双抗体PEG法 将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。 本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间长和沉淀法非特异性结合高的缺点。 4．固相分离法 将抗体通过特殊技术联结在固相载体上，免疫反应在固相载体上完成，达到平衡