基于细胞培养筛选抗对虾白斑综合征病毒(WSSV)中草药及其实验效果评价-渔业专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士学 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 战文斌 中国海洋大学 教授 答辩主席 李军 中科院海洋研究所 研究员 答辩委员 姜国良 中国海洋大学 教授 答辩委员 曲凌云 国家海洋局第一海洋研究所 研究员 答辩委员 柳学周 黄海水产研究所 研究员 答辩委员 史宝 黄海水产研究所 助理研究员 答辩秘书 答辩地点 黄海水产研究所 答辩时间 2014-5-31 基于细胞培养筛选抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）中草药 及其实验效果评价 摘 要 随着对虾养殖规模的扩大、养殖环境的恶化，对虾病毒病大范围 暴发，探索对虾病毒的感染机制、致病机理、传播途径等是防止其进 一步曼延的基础，尽管国内外许多专家学者在对虾病毒性疾病防控技 术上做出了不懈的努力，取得了一定的研究成果，但对虾疾病并未取 得理想的防治效果。目前，随着细胞分子生物学、基因工程、计算机 技术等学科的发展，出现了高效、快速的药物筛选模型，在新药的筛 选和研发中发挥了积极的作用。结合细胞培养技术筛选有抗对虾白斑 综合征病毒作用的中草药，防止对虾病毒性疾病的大肆传播，将为对 虾养殖业的快速稳定发展提供有力的技术支持。 1. 刀额新对虾原代淋巴细胞培养及其感染白斑综合征病毒（WSSV） 的病理特征 配制改良的 1.5×L-15 培养基对刀额新对虾（Metapenaeus ensis，又 名基围虾）淋巴组织进行体外培养，初步建立药物筛选的细胞平台。 同时，使用蔗糖密度离心法提取 WSSV 病毒粒子，以纯化的病毒感染 淋巴细胞，倒置显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜下观察接种病 毒后细胞的病理变化，为药物筛选提供判断依据。结果表明，使用添 加 SME、FBS、EGF、bFGF、青霉素钠和硫酸链霉素的 1.5×L-15 培养 基培养刀额新对虾淋巴细胞，组织干贴 3 h 以后可观察到有细胞从组织 I 块中迁出，36 h 后细胞的迁出汇合率可达 80%，且单层细胞能维持 20 d 以上。待淋巴细胞形成单层后，接种纯化的 WSSV，24 h 后，出现病 变的细胞变圆、漂浮，细胞之间的网状结构消失，最后细胞破碎、溶 解；接种 WSSV 48 h 后 Hoechst 33342 染色结果显示，感染的细胞核深 染，且变形、膨大；电镜下，细胞核内含大量成簇分布的杆状病毒， 细胞器被挤向细胞边缘，细胞膜轮廓模糊。 2. 抗对虾白斑综合征病毒中草药的初步筛选 建立抗病毒中草药细胞水平筛选模型，筛选具有抗 WSSV 作用的 中草药。利用传统的水提取方法提取中草药的有效成分，过滤、离心、 除菌后与纯化的 WSSV 病毒粒子混合，将混合液接种淋巴细胞，收集 出现病理变化的细胞进行基因组 DNA 的提取，合成 WSSV 的荧光定 量引物，构建重组质粒作为绝对定量的标准品，列标准曲线方程 y=-3.475x+28.92，相关系数 R2=0.999，扩增效率 E=0.94，对 WSSV 进 行绝对定量分析，计算各样品中病毒粒子单位质量拷贝数，通过观察 细胞的病理变化和病毒拷贝数的差异判断药物对病毒的直接灭活作 用，来筛选具有抗 WSSV 作用的单方中草药。结果发现，AWH-2、 AWH-8、AWH-12、AWH-16、AWH-22、AWH-30 中草药具有抗 WSSV 作用，猜测可能阻断了病毒的吸附增殖从而起到了抗病毒效果。 3. 抗对虾白斑综合征病毒复方中草药的筛选及临床验证 2 倍梯度稀释具有抗病毒作用的单方中草药，接种淋巴细胞后观察 细胞的病理变化，确定药物对于细胞的最大安全浓度。结果显示， II AWH-2、AWH-8、AWH-12、AWH-16、AWH-22、AWH-30 中草药的 最大安全浓度分别为 25 mg/mL、6.25 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、 50 mg/mL、25 mg/mL。在中草药最大安全浓度下以相同百分比的量混 合，接种单层淋巴细胞，初步确定有抗病毒作用的最佳复方中草药。 将筛选出的复方中草药应用于临床实验，通过观察对虾的摄食、游动、 体色变化、死亡情况判断其作用效果，结果发现，复方中草药的体内 与体外抗病毒研究结果基本一致。 综上所述，本文以改良的 1.5×L-15 培养基培养刀额新对虾淋巴细 胞，待迁出细胞形成单层后接种纯化的 WSSV，建立体外抗病毒药物 筛选模型。以病毒引起细胞的病理变化及病毒在细胞内的拷贝数为判 断依据，筛选有抗 WSSV 作用的单方中草药；在中草药的最大安全浓 度内对单方中草药进行组方，通过临床应用验证复方中药的体内抗病 毒效果。本文研究结果为防止对虾病毒性疾病的暴发和感染 WSSV 后 对虾的大范围快速死亡以及对虾健康养殖提供理论依据，以期