代谢工程课件.pptVIP

3) 全局扰动技术(Global perturbation): 在优化微生物生理性能时， 很多情况下不知道明确的靶基因和调控因子。 全局扰动技术主要有以下几种: (a) 转座子 突变(Transposon mutagenesis): 可以在微生物全基因组上造成随机基因敲除。 。(b) 质粒编码的基因组文库(Plasmid-encoded library): 通过大量表达质粒编码的基因组文库，随机提高一个或多个基因的表达, 从而提高目标产物的合成。 实例 Lee 研究小组运用系统代谢工程成功改造了大肠杆菌用于缬氨酸(Valine)的发酵生产。 他们首先分析了缬氨酸合成途径的局部代谢网络，使用位点特异突变解除了所有已知的缬氨酸合成途径中的反馈抑制和转录消减效应，使用基因敲除阻断了缬氨酸合成的竞争途径，并通过质粒过量表达扩增了缬氨酸合成第一步反应酶的基因。 传统代谢工程策略得到的起始工程菌生产缬氨酸的产率提高到0.066 g/g 葡萄糖。在进行第二轮改造时, 他们通过转录组分析成功鉴定出能有效提高缬氨酸合成的亮氨酸应答蛋白和缬氨酸转运蛋白基因，这些调控回路的扩增使缬氨酸合成产率提高了一倍。同时, 他们通过基因组代谢网络模型模拟分析成功鉴定出另外3 个基因敲除靶点，这些基因的敲除使缬氨酸的产率提高到0.378 g/g 葡萄糖。 八、合成生物学 合成生物学是以工程学理论为依据，设计和合成新的生物元件，或是设计改造已经存在的生物系统。这些设计和合成的核心元件(如酶、基因电路、代谢途径等)具有特定的操作标准; 小分子生物元件可以组装成大的整合系统，从而解决各种特殊问题。如可再生生物能源和化合物的生产、药物前体合成、基因治疗等。 合成生物学和传统的代谢工程在用于微生物发酵生产时, 其目的是一样的, 区别在于所使用的技术方法。 传统的代谢工程是从整体出发, 先研究微生物的代谢网络, 分析控制代谢通量分布的调控节点, 再在关键节点处进行遗传改造, 从而改变细胞的代谢网络和代谢通量分布; 合成生物学则是从最基本的生物元件出发, 按照标准的模式和程序, 将生物元件一步步地组装, 整合成一个完整的系统(化合物的合成代谢途径)。 代谢工程的发展 合成生物学发展四个重要技术 首先是测序 了解原有的系统才能更好的设计新的系统； 第二计算机模拟建模 了解了整个生命系统的构成，通过计算机模拟建模分析，编制我们想要实现的新的生命体系； 第三 获得新的基因； 最后是通过移植技术获得新的生命细胞。 一方面要建立合成生物学工程技术平台和研究实验体系，实现关键工程科学问题的重大突破； 另一方面要揭示细胞工厂和分子机器的运行机理和构造原理，实现优化设计，提高元件、网络的合成能力和调控能力。 合成生物学技术在微生物改造应用优势 1) 能减少遗传改造的时间、提高改造的可预测性和可靠性。 2) 能创建有用、可预测、可重复使用的生物部件, 如表达调控系统、环境应答感应器等。 3) 能有效地将多个生物部件组装成具有功能的装置。 * * * * 完全 * 三、代谢工程的研究概要 代谢工程的一个基本目标是阐明代谢流控制的因素和机制，而系统研究代谢流及其控制机制有三大基本步骤： 第一，建立一种尽可能多的观察途径并测定其流量的方法； 第二，在代谢网络中施加一个已知的扰动，以确定在系统达到新的稳态时的代谢途径； 第三，系统分析代谢流的结果。 四、代谢工程的研究技术与工具 代谢工程的多学科性质决定了它的发展优势，同时也暗示了它在研究方法和技术方面的综合性，主要可归为三类： 第一，检测技术。 第二，分析技术。 第三，操作技术。 检测技术 常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究，如同位素示踪——确定代谢流的物料平衡；还有表征酶反应进程的酶动力学分析方法；测定同位素富集和关键代谢物相对分子质量的质谱及光谱学方法，如核磁共振。根据这些测量信息可以判断和描述体内代谢流的基本状态，并为细胞代谢流及其控制分析提供翔实可靠的原始数据。 分析技术 在获得大量生化反应基本数据基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法，并结和计算机技术可以进一步阐明细胞代谢途径和代谢网络的动态特征与控制机理，同时确定途径改造的关键靶点。这些手段包括测定细胞内代谢流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂网络分析的组合法，即时生化反应甚至基因表达调控定量化的计量法等。 操作技术 代谢工程中，代谢途径和代谢网络的操作实质上可以归纳为基因水平上的操作。如基因和基因簇的克隆、表达、调控；DNA的杂交检测与序列分析等。 四、代谢工程的研究技术与工具 研究工具 分子生物学工具：几乎所有基因