课件：分子生物学实验设计蚕豆病.ppt

生理盐水、溶血素 、3.8mmol/L NADP 、0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.5） 、0.63mol/L氯化镁溶液 、33mmol/L G-6-P液 紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管 主要试剂和仪器 试剂： 仪器： 实验流程 取抗凝血2ml，生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心 10min） 除去上清液和乳白层（白细胞和血小板） 加等体积生理盐水→红细胞悬液 红细胞悬液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min → 溶血液 并测定其Hb浓度 进行比色 （见下表） G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 ) 试管 对照管 测定管 NADP液（ml） 0.1 0.1 Tris液（ml） 0.1 0.1 氯化镁液（ml） 0.1 0.1 蒸馏水（ml） 0.68 0.58 G6P液（ml） — 0.1 37℃预热 溶血液（μl） 20 20 立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37℃恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化 计算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =△A/min×1000/6.22×1020/20× Hb(gL-1) △A/min:每min吸光度的平均变化值 1000/6.22:为微摩尔消光系数 1020/20:总容量与溶血液的量之比； 注意事项 1、急性溶血期后2~3个月再查或复查G6PD活性 2、最好同时作阴性对照和阳性对照（影响因素多） 3、离心沉底后应取底层红细胞测定 G6PD活性 结果分析 G6PD缺陷者： G6PD活性较正常平均值低40%以上即可作出诊断 方法 正常值范围 WHO推荐的Zinkham （12.01±2.09) IU/gHb(37℃) ICSH推荐的Glock与McLoan法 （8.34±1.59）IU/gHb(37℃) NBT定量法 （13.1~30.0）NBT单位 Chapman和Dern法 （2.8~7.31）IU/gHb(25℃) 根据实验结果 该男孩患蚕豆病 3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。 ①细胞膜的破坏 ②胆红素的异常  红细胞膜的破坏 葡萄糖磷酸戊糖途径 葡萄糖 6 – 磷酸葡萄糖 5 – 磷酸核糖 NADPH + H+ 磷酸化 5 – 磷酸核糖 磷酸戊糖途径 NADPH + H+ 5 – 磷酸核糖 NADPH + H+ 5 – 磷酸核糖 NADPH + H+ 5 – 磷酸核糖 NADPH + H+ NADPH维持GSH(谷胱甘肽）的正常含量和还原状态 G6PD (6 – 磷酸葡萄糖脱氢酶）起关键作用 还原型谷胱甘肽 体内重要的抗氧化剂 保护红细胞膜蛋白的完整性  红细胞膜的破坏 单核吞噬细胞识别吞噬 血红蛋白 氧化破坏 血红素 珠蛋白 红细胞  单核吞噬细胞识别吞噬 血红蛋白 珠蛋白 氧化破坏 红细胞 氧化破坏 红细胞 单核吞噬细胞识别吞噬 红细胞 血红蛋白 单核吞噬细胞识别吞噬 红细胞 珠蛋白 血红蛋白 单核吞噬细胞识别吞噬 红细胞 血红素 珠蛋白 血红蛋白 单核吞噬细胞识别吞噬 红细胞 胆红素代谢异常 血红素 运送到肝 与血清蛋白结合 游离胆红素 结合胆红素 排出体外 进入肠道 胆素原 胆素 肠肝循环 胆红素 ↑ 扩散进入组织 组织黄染 黄疸 排尿呈酱油样色 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 溶血性贫血 面色苍白 ↑ 5.患者体型瘦小与