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结课论文 题目名称： 16S rRNA 在细菌鉴定与分类中的 应用 学生姓名： 刘 * 学 号： 2016304110*** 专 业： 生物化学及分子生物学 结业课程： 系统细菌学 中国·武汉 2016 年 12 月 16S rRNA在细菌鉴定与分类中的应用 刘* 2016304110*** 华中农业大学生命科学学院，武汉 [摘要]：由于细菌种属间生理生化特征的相似，单凭传统的表型和化学鉴定方法已无法准确对其进行分类鉴定。随着包括PCR技术、测序技术等分子技术的不断进步，细菌的分类鉴定也由在最初的表型和化学鉴定演变到分子水平，使人们可以通过对细菌的DNA鉴定来达到区分种属的目的。细菌的16S核糖体RNA(rRNA)以其在进化上的特征性序列，基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。 关键词：16S rRNA；细菌分类鉴定；DNA测序；高级结构 传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。 20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。在PCR技术的产生发展基础上，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因(rDNA)指纹图、16S核糖体核糖核酸(rRNA)序列分析等。这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。特别是16S rRNA基因序列分析技术的出现，使细菌进化与否可以通过试验研究来证实。目前，关于PCR扩增16S rRNA基因用于细菌分类和鉴定的研究越来越多，大多数细菌的16S rRNA基因均已被测序。本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。 1.16S rRNA基因 16S rRNA为原核生物的一种核糖体RNA。目前，细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟是rRNA，其种类少，含量大(约占细菌RNA总量的80%)，分子大小适中，在漫长的生物进化过程中，其基因序列的变化非常缓慢，可以用来标记生物的进化距离和亲缘关系具有良好的时钟性质；在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。 细菌中编码rRNA基因按5`.16S.23S.5S.3`方式排列的，由2个非编码的间隔区序列(InternalTranscribedSpacers，ITS)分开，5SrRNA、16S rRNA和23SrRNA3部分组成一个RNA操纵子，作为一个单位转录，再加工成为成熟rRNA。16S rRNA是所有原核生物蛋白质合成必需的1种核糖体RNA，其具有以下特点:(1)多拷贝。每个细菌含5～10个16S rRNA拷贝，这使得检测敏感性较高。(2)多信息。16S rRNA基因内部结构由可变区和保守区组成。保守区为所有细菌所共有，可变区在不同细菌之间存在不同程度的差异，具有属或种的特异性，可变区与保守区交错排列。因此，可根据保守区设计各种细菌的通用引物，也可根据可变区设计特定细菌的特异引物或探针。16S rRNA基因可变区所含信息的种间差异，使检测具有特异性。(3)长度适中。16S rRNA编码基因长度约1500bp，包含大约50个功能域。 2. 16S rRNA序列分析鉴定细菌的原理和方法 通过比较各类生物16S rRNA的基因序列，从序列差异计算它们之间的进化距离，可以绘出生物进化树。因此，16S rRNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中16S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rRNA序列信息，再与16S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。 2.1基因组DNA的获得 首先从微生物样品中直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培养富集