蛋白质结构测定的方法.pptVIP

X射线衍射研究大分子的局限性 进行X射线衍射谱的分析，通常高纯度的材料是必须的，首先实验样品应该仔细结晶，去获得高品质的适合X射线衍射研究的晶体。即使可以得到合适的结晶，大分子体系结构的测定仍然比小分子要困难得多。这是因为数目众多的大分子体系结构中的原子结构确定很困难。 同时对仪器要求的复杂性及数据分析都需要消耗大量的计算时间。X射线衍射必须在分子固相中进行，由此获得的结构信息可能就会与分子体系在生物活性状态的情况有所不同。 近年来，科学家们努力地发展建立了结晶学软件，大大加快了蛋白质结构测定的步伐。以前需要几周甚至几个月才能完成的工作，现在有可能在几小时到几日内完成。 完 　蛋白质空间结构国内外研究动态 在国际上,美国首先提出大规模测定蛋白质结 构的计划,现在已经进入第二期的产出阶段. 其他发 达国家(欧盟和日本)也相继启动自己的结构基因 组计划. 我国根据美国第一期的试验计划,发现X射线晶体学仍然是测定结构的主要手段,这与预期的结果相符. 过去和现在情况都是这样,蛋白质结构数据库中的80%的结构来自X射线衍射. 其他有重要贡献的手段有核磁共振和低温冷冻电镜( cryo2EM). 由于这三种方法的重要性,最近几年,它们都有很大的改进. 理论方法的进展也非常快,与实验的结合也越来 越紧密. 尤其是蛋白质折叠的机制成为研究的热点和 焦点. 预测蛋白质构象的理论方法 蛋白质折叠的成核理论 同源模型方法 分子动力学 蒙特卡罗方法 折叠识别法 线索化方法 混合方法 从头预测法 等。。。。。。 同源模型方法 任何两种蛋白质，如果它们的序列等同部分超过30％，它们就具有相似的空间结构，即两个蛋白质的基本折叠相同，只是在非螺旋和非折叠区域的一些细节部分有所不同。据此，同源模型法的基本思想是：对一个未知结构的蛋白质，首先通过同源分析找到一个已知结构的同源蛋白质，然后，以该蛋白质的结构为模板，为未知蛋白质建立空间结构模型。 分子动力学 蛋白质动态构象模拟的最常用的计算方法是分子动力学. 分子动力学是在相空间(位置和动量空间)中计算系统随时间变化的轨迹. 对系统的系综平均就是对系统在时间轨迹上的平均. 测定蛋白质构象的实验方法 方法 提供的结构信息 主要指标 应用 X-光衍射 除了氢以外肽链所有原子排布 衍射点的强度和位置 最重要 NMR 溶液蛋白构象； 构象动力学 化学位移；谱线强度；自璇耦合常数 越来越多 很重要 CD 二级结构及变化 椭圆度 很多 荧光光谱 芳族氨基酸微区； 构象变化 发射、激发光谱 量子产率 很多 紫外差光谱 芳族氨基酸微区； 构象变化 吸收变化 很多 STM 表面原子结构分布 隧道电流及其变化 较多 氢同位素交换 规则二级结构； 氢键数目 与环境水不可交换的肽键氢的数目 较少 激光拉曼光谱 二级结构 拉曼光谱 尚不成熟 小角中子衍射 肽链所有原子排布 散射强度的角分布 起步不久 一 溶液中蛋白质分子构象的研究方法: 利用各种光谱学方法测定不同条件下蛋白质溶液光谱性质的差异，来确定其构象，以及与功能的关系 （一）吸收光谱：用不同波长光照射蛋白，检测透光强度， 以吸光度A ~ 波长λ作图。常温，低温 蛋白质吸收来自两个部分： 可见光区(400-770nm)：来自配基，如Cytc Trp = 280nm 紫外区(200-400nm) ：蛋白本身 Tyr = 275nm Phe = 257nm 肽基团=190~225nm 可见光吸收谱，紫外吸收光谱 （二） 荧光光谱法 （fluorescence spectrum): 有些物质吸收入射光后经过一段很短时间, （10 - 9 ~10 - 8 s）又发射出波长比原来长的光——荧光 激发能的耗散：①热运动 ② 传递给相邻分子 ③发荧光形式 蛋白自身的荧光: λTrp = 348nm； λPhe = 282nm；