蛋白质组学与分析技术第三讲.pptVIP

蛋白质组学与分析技术 邱德文 中国农科院植物保护研究所 2010。3。24 蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析 蛋白沉淀步骤 硫酸铵沉淀（盐析）：高盐溶液中蛋白质聚合而沉淀 TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA 10%-20%，蛋白质可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除TCA 丙酮沉淀：3倍体积的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，离心沉淀蛋白，丙酮通过空气或冻干去除 在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：两者联合使用更有效，10%的TCA在丙酮中重悬裂解样品溶液 用苯酚提取，随后在甲醇中醋酸铵沉淀：蛋白质被提取到饱和酚中，在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白，丙酮清洗 聚丙烯酰胺凝胶电泳 通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构 等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS按相对分子质量大小分离蛋白质 聚丙烯酰胺凝胶电泳 通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构 等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS按相对分子质量大小分离蛋白质 胶上蛋白的检测 蛋白质检测常用考马斯亮蓝染色 银染 负染 荧光标记、同位素标记，提高灵敏度和自动化水平 层析分离纯化技术 蛋白质层析分离纯化技术 蛋白质薄层层析（硅胶板+层析缸） 蛋白质柱层析（葡聚糖、硅胶填料） 蛋白质分析制备仪 层析分离技术(chromatography) 层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。 凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。 亲和层析(affinity chromatography) 在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。 离子交换层析(ion-exchange chromatography) 离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法 . 柱层析分离 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所 以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长. 减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过 硅胶会使溶剂挥发，以前曾经大量的过 减压柱，但是自从尝试了加压后，就很少使用减压柱色谱了。 蛋白质分析制备仪 选择纯化设备 HiTrap? Chelating 高效纯化策略 准备工作 考虑: 纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济 蛋白质特性: 稳定性 - pH - 离子强度 - 温度 分子量 等电点 pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变 pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变 样品准备 考虑: 根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理 用缓冲液维持 pH, 离子强度 目的: 稳定样品 三步纯化策略 三步纯化策略 三步纯化策略 三步纯化策略 粗提 目的 纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析 粗提: 离子交换填料 粗提: 疏水层析填料 高载量 高流速 HiPrep? 16/10 Phenyl (高 低取代) HiPrep 16/10 Butyl HiPrep 16/10 Octyl 中度纯化 目的 去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析 中度纯化: 离子交换填料 中度纯化:疏水层析填料 精细纯化 目的 达到最终纯度 (去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术: 凝焦过滤/离子交换