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QA 关于对照 关于酶切，连接 感受态细胞的制备 连接产物转化克隆菌株 * 基因的克隆与表达专题之四 无菌 轻柔 冰浴 制备感受态细胞流 程 预 培 养 （昨天下午）： LB培养基（3mL，含12.5μg/mL Tet） 37 ℃ 、190rpm振荡培养过夜 扩大培养(今天早晨）： 0.4mL预培养菌液 ＋ 40mL LB液体培养基（含12.5μg/mL Tet） 37 ℃ 、250rpm振荡培养2.5-3小时 NovaBlue 配制液体并高压 LB液体培养基 140mL 胰蛋白胨（typtone) 0.8g 酵母提取物（yeast extract) 0.4g NaCl 0.8g 先加80mL水溶解后，再加16μL 5mol/L NaOH。分装40mL到250mL锥形瓶（2瓶），其余分装到大试管中（4mL/管×14管） 2. LB固体培养基 200 mL LB液体培养基中含1.2％的琼脂，灭菌后待温度降到60℃左右，加入50 μ g/mL Carb、12.5 μ g/ mL Tet 、70 μ g/mL X-gal和80 μ mol/L IPTG混匀（均为终浓度）,立即铺平板10块 3. 0.1mol/L的CaCl2 100mL／两组 收集细胞： 终止培养（OD600 0.4-0.5 ） 转移菌液到50mL离心管中，冰浴10min 离心（4℃， 4000rpm × 10min ）！！！ 弃液: 倒出培养液，将管倒置使培养液流尽 制备感受态： 穿孔：加入预冷的CaCl2（ 0.1 mol/L，10mL） 轻柔吹悬菌体细胞（用5 mL枪头） 冰浴 30min 收集：离心（4℃，4000rpm × 5min），弃上清 保存：预冷的CaCl2 （0.1 mol/L， 2mL） 冰上轻柔吹悬菌体细胞 分装保存：200uL/份（ -20 ℃短期或-70 ℃稍长期冻存） 感受态 连接产物转化克隆菌株 1、样品制备 用枪头轻柔混匀，冰上放置30min 0.1 mol/L CaCl2 （200μL） ＋ 连接产物 2μL 感受态细胞（200μL） ＋ 无菌水 2μL 感受态细胞 （200μL ） ＋ 质粒DNA 2μL（5－50ng) 感受态细胞（200μL） ＋ 连接产物10μL 阴性对照2 阴性对照1 阳性对照 实验管 对照的作用？？？ 注意：无菌！轻柔！冰浴！ 2、转化 42 ℃水浴热激90秒 冰浴2分钟 3、复苏 每管加800μL LB液体培养基 37 ℃慢摇1小时（150rpm ） 4、选择性筛选 浓缩菌液：离心（4000rpm × 1min） 吸弃900uL上清，吹悬剩余细胞 涂 板： 取50uL细胞悬液，涂布在选择平板上， 倒置培养过夜（37 ℃ ） 复苏目的？ 预实验结果 阴性对照 阳性平板 仪器使用与注意事项 离心前，一定要在超净台中 绝对平衡！！！ 下次实验的简介与准备
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