海水养殖鱼哈维弧菌分离株多位点序列分析及耐药谱型研究-临床兽医学专业论文.docxVIP

上海海 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 答辩地点 答辩日期 海水养殖鱼哈维弧菌分离株多位点序列分析及耐药谱型研究 摘 要 哈维弧菌（Vibrio harveyi）是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于海水养殖环境，能够在有利条件 下感染水产动物，引起宿主复杂多样的临床致病症状，造成非常高的死亡率，给水产养殖经济产业 带来巨大打击。然而，此菌与其类似菌种如坎氏弧菌、副溶血弧菌等具有极其高的表型和基因型相 似度，对其进行准确的鉴定分型存在诸多困难。此外，对该菌的耐药谱型特点进行研究可为流行病 学调查和合理用药提供指导，是许多研究者目前关注的重点。本研究利用多位点序列分析法对采集 自 2007-2012 年我国南方沿海地区患病海水鱼的哈维弧菌分离株进行鉴定分型，探究多基因位点序 列对哈维弧菌类似群的区分力及哈维弧菌分离株多基因位点分型情况。采用 K-B 法对鉴定的哈维弧 菌分离株进行 12 种抗生素的敏感性实验，研究其耐药谱型特点，运用耐药性情况 SPSS 聚类分析进 一步对哈维弧菌分离株进行分型，探究分型的菌株的耐药性特征。结果如下： 1. 利用 6 个保守基因位点 16S rRNA、mreB、rctB、rpoD、topA、toxR 分别对 210 株采样分离株进 行测序鉴定。通过 PCR、测序比对得到 95 株哈维弧菌类似群菌株，7 株创伤弧菌菌株；基因序列 的进化分析和系统进化树构建表明，除 toxR 基因外，其余基因在进化过程中均存在基因重组事件， 系统进化树中不能将哈维弧菌类似群菌株完全区分；各基因序列在哈维弧菌种内遗传相似度分别为 99.1~100%（16S rRNA）、91.1~100%（mreB）、98.5~100%（rctB）、87.1~100%（rpoD）、86.6~100% （topA）、98.4~100%（toxR），在哈维弧菌类似群菌株间的种间遗传相似度依次为 98.4~99.9%（16S rRNA）（不包括 V. communis）、87.0~98.4%（mreB）、73.2~98.9%（rctB）、80.8~100%（rpoD）、75.9~100% （topA）、24.4~78.9%（toxR）；基因的区分力为，毒力蛋白编码基因 toxR＞保守蛋白编码基因（mreB、 rctB、rpoD、topA）＞16S rRNA 。 2. 基于串联基因序列进化分析及构建系统进化树发现，串联基因序列分析能够降低重组基因事件的 影响，将哈维弧菌类似菌株在系统进化树中有效的分支，其中 rctB-toxR 基因的串联在进化树中的 分支结果与 mreB-rctB-rpoD-topA-toxR 串联的一致，均能最好的将哈维弧菌类似群菌株区分，最终 获得哈维弧菌分支包括 84 株分离株，占分离株的 40.0%；V. communis 分支含有 2 株分离株（0.95%）； 2 株分离株聚为副溶血弧菌；4 株分离株归为轮虫弧菌（1.9%）；3 株分离株鉴定为溶藻弧菌（1.4%）。 3. 基于 5 基因（mreB-rctB-rpoD-topA-toxR）串联分析的哈维弧菌分离株分型情况发现，84 株哈维 弧菌分为 a-k 共 11 个亚支，各亚支菌株来源分布各有特点，其中，a、b、c 亚支均只有一株，分别 分离自 2010、2011 年广东地区养殖的患病卵形鲳鲹及 2011 年福建地区养殖的患病红鳍笛鲷；d 亚 支含有 18 株分离株，占 21.4%，其石斑鱼分离株均分离至海南地区，而卵形鲳鲹及点篮子鱼分离 I 株均来源于广东地区；e 亚支的 6 株菌株均分离自患病的卵形鲳鲹；f 亚支的 7 株分离株均采集于 2011 年；g 亚支的 4 株分离株全部来自广东地区；聚为 h 亚支的 15 株分离株包含的宿主种类多达 7 种（包括 4 种不同的石斑鱼种类）；i 亚支包括参考菌株 V. harveyi ATCC 33868 与尖吻鲈分离株 104CCL；j 亚支由 2 株红鳍笛鲷分离株、8 株石斑鱼分离株、标准株 V. harveyi ATCC 14126、参考 株 V. harveyi LMG 4044 构成；k 亚支包括 20 株分离株，占 23.8%，从采集地域看，4 株广西地区分 离株均聚在该亚支中，从采集的年份看，2010 年的分离株（除 72BKI 外）亦均聚在该亚支，2012 年的菌株仅有 1 株分布于此分支中，从分离的宿主看，该亚支 90.0%（18 株）的菌株从石斑鱼上获 得。可见，来源不同的分离株可以聚落为同一亚支，相同来源的分离株也可以分布在不同的亚支中， 这表明来源不同的哈维弧菌分离株可以具有相似的基因型，来源相同的哈维弧菌分离株的