哈茨木霉几丁质酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达-微生物学专业论文.docxVIP

哈茨木霉几丁质酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 哈茨木霉几丁质酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 贵州大学 贵州大学 2009 届硕士研究生学位论文 PAGE PAGE 2 PAGE PAGE 3 HYPERLINK \l _bookmark0 RT-PCR 反应 26 HYPERLINK \l _bookmark1 几丁质酶基因保守区的纯化、克隆测序 27 HYPERLINK \l _bookmark2 2.3.8 哈茨木霉几丁质酶基因全长的克隆与序列分析29 HYPERLINK \l _bookmark2 cDNA 的第一链合成 29 HYPERLINK \l _bookmark3 cDNA 末端的快速扩增(RACE) 30 HYPERLINK \l _bookmark4 哈茨木霉几丁质酶基因全长序列的分析 31 HYPERLINK \l _bookmark5 2.3.9 毕赤酵母表达载体 pPIC9K-Thchit44 的构建与验证 31 HYPERLINK \l _bookmark5 目的 DNA 片段的 PCR 产物纯化 32 HYPERLINK \l _bookmark6 质粒 DNA 的提取 32 HYPERLINK \l _bookmark6 PCR 产物的酶切 33 HYPERLINK \l _bookmark7 质粒 DNA 的酶切 33 HYPERLINK \l _bookmark7 质粒 DNA 与目的片段 DNA 的连接 33 HYPERLINK \l _bookmark8 毕赤酵母表达载体酶切验证34 HYPERLINK \l _bookmark8 2.3.10 毕赤酵母表达载体的电转化34 HYPERLINK \l _bookmark8 线状化质粒 DNA 34 HYPERLINK \l _bookmark8 表达载体的电击转化34 HYPERLINK \l _bookmark9 重组子的鉴定 35 HYPERLINK \l _bookmark9 2.3.11 重组酵母的诱导表达 35 HYPERLINK \l _bookmark9 多拷贝 His+Mut+克隆的筛选 35 HYPERLINK \l _bookmark9 重组蛋白的诱导表达35 HYPERLINK \l _bookmark10 2.3.12 重组蛋白的 SDS分离与纯化 36 HYPERLINK \l _bookmark11 第三章 结果与分析 37 HYPERLINK \l _bookmark11 3.1 哈茨木霉诱导产几丁质酶的研究37 HYPERLINK \l _bookmark12 3.2 哈茨木霉基因组 DNA 与总 RNA 的分离 37 HYPERLINK \l _bookmark12 3.2.1 哈茨木霉总 RNA 的分离 37 HYPERLINK \l _bookmark12 3.2.2 哈茨木霉基因组 DNA 的提取 38 HYPERLINK \l _bookmark13 3.3 哈茨木霉几丁质酶 cDNA 特异性片段的 RT-PCR 扩增 39 HYPERLINK \l _bookmark14 3.4 哈茨木霉几丁质酶 cDNA 的 3’/5’-RACE 扩增 39 HYPERLINK \l _bookmark14 3.5 哈茨木霉几丁质酶基因全序列分析40 HYPERLINK \l _bookmark14 3.5.1 哈茨木霉几丁质酶 cDNA 序列分析 40 HYPERLINK \l _bookmark15 3.5.2 基因组 PCR 获得内含子 DNA 序列 40 HYPERLINK \l _bookmark16 3.5.3 哈茨木霉几丁质酶三级结构的预测45 HYPERLINK \l _bookmark17 3.6 不同来源几丁质酶的系统发育分析45 HYPERLINK \l _bookmark18 3.7 酵母表达载体 pPIC9K-Thchit44 的构建及鉴定 48 HYPERLINK \l _bookmark18 酵母表达载体 pPIC9K-Thchit44 的构建 48 HYPERLINK \l _bookmark18 酵母表达载体 pPIC9K-Thchit44 的鉴定 48 HYPERLINK \l _bookmark19 3.8 重组毕赤酵母的筛选及鉴定49 HYPERLINK \l _bookmark19 3.9 重组毕赤酵母的诱导表达