海洋类固醇降解菌初步研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

汕头 汕头大学硕士学位论文 摘要 环境激素是指环境中具有与人和动物体内激素相似的化学结构和作用的一类化学物 质。这一类化合物进入人体发挥激素的作用；影响体内激素的合成、运输、释放和代谢； 扰乱内分泌系统、生殖系统及神经系统的功能；造成机体免疫和生殖等功能的障碍。以雌 激素及其类似物为主的类固醇激素是环境激素中的一类。目前已经在近海水域中检测到超 过正常水平的雌激素。鉴于微生物在降解和环境污染物治理中所具有的独到的优势，本文 拟初步探索海洋微生物降解类固醇激素的可能性和可行性。主要结果如下： 1．从汕头港和南澳岛海水养殖区采集环境样品，筛选类固醇激素降解菌株 39 株，大 多数菌株可以降解五种底物的 3-4 种，菌株 X 和 Y3 能够降解本实验用的全部底物，菌株 N8 和 Y18 只能降解雌二醇、N9 和 N12 只降解胆固醇以及 Y20 只利用雌三醇。优势菌 N1、 N3 和 N6 属于 Vibrio，菌株 C、Y2 分别为 P. ganghwense 和 A. venetianus。 （1）从菌液浓度、总蛋白量、降解率及蛋白表达比较分析，证明菌株 N1、N3、N6 和 N13 降解睾丸酮的能力。对具强降解睾丸酮、宽降解谱的菌株 N3 进行降解睾丸酮的条 件优化和生理生化分析： （2）利用 Plackett–Burman 实验和响应面法中心复合设计（CCD）法，确定菌株 N3 降解睾丸酮的最佳条件为：起始 pH 为 7.95、酵母提取物为 68.06 mg L-1、氯化钠为 31.2 g L-1、 硫酸铵为 1.75 g L-1、温度为 25℃、磷酸氢二钾为 0.25 g L-1、葡萄糖为 0.25 g L-1 和转速为 150rpm。在最佳条件下，菌株的睾丸酮降解率与模型预测相符。 （3）菌株 N3 为革兰氏阴性细菌，有运动性，进行发酵型产酸，不能利用色氨酸生成 吲哚，不能利用柠檬酸钠为碳源，不含有丙酮酸脱羧酶。菌株对高浓度(150 ?g ml-1)的氨苄 青霉素、羧苄青霉素、青霉素、壮观霉素和低浓度的链霉素、萘咛酮酸、卡那霉素有抵抗 作用，对低浓度的氯霉素、四环素和利福平敏感。结合 16S rRNA 基因序列进化树分析， 将菌株命名为 Vibrio sp. N3。 2．柘林湾网箱鱼排养殖区筛选雌酮和雌二醇降解菌： （1）筛选得到雌酮降解菌株 38 株，雌二醇降解菌 103 株。测定 72h 内降解菌降解 0.1 mM 底物降解率，多数雌酮降解菌降解率在 65%-85%之间，只有 4 株的降解率在 85%以上， 没有达到 90%的菌株；101 株雌二醇降解菌多数底物降解能力较强，强底物降解能力的菌 株接近总数 1/4，少数菌株的雌二醇降解率达到 90%，最高的 ZE2-59 达到 91.47%。 I （2）随机从雌酮和雌二醇降解菌中分别抽出 12 株和 16 株进行菌株的 16S rRNA 基因 鉴定。12 株雌酮降解菌都属于 Vibrio 菌属，9 株与标准菌株 V. communis R-40496(T)高度相 似。16 株雌二醇降解菌分布比较广，种属较多分属于变形菌门 α、β 和 γ 3 亚门 4 目 4 科 4 属， 10 株属于 Vibrio，其中与 V. communis 相似性最高有 5 株。 3．选择 “南海基金 DFH11 航次”第一航段和第二航段海水样品，筛选 17β-乙炔基雌二 醇降解菌。第一航段和第二航段分别筛选得到 11 株和 43 株降解菌。 从第一航段和第二航段分别抽出 5 株和 34 株做菌株的 16S rRNA 鉴定和比对分析。第 一航段株菌经鉴定按照最高相似度分类属于 Vibrio 属的两个不同的种，4 株为 V. rotiferianus 为优势菌种。第二航段 34 株菌分属于 Nitratireductor、Martelella、Labrenzia、Aurantimonas、 Hoeflea、Ruegeria、Citreicella、Citromicrobium、Kordiimonas、Thalassospira、Halomonas 和 Pseudomonas 等 12 个菌属，有的菌属有 6 株菌如 Nitratireductor 和 Thalassospira；有的 只有 1 株如 Aurantimonas、Hoeflea 及 Citromicrobium，其他的大多为 2 到 5 株不等。 关键词：类固醇激素；海洋；降解菌；Vibrio sp. N3 II PAGE PAGE VI Abstract Environmental hormone is a type of chemical substances existing in the environment, whi