第11章 遗传工程.pptVIP

什么是遗传工程？ 体外DNA重组技术：利用工具酶将外源片段和载体连接，导入生物体并使其稳定复制和传代的技术 工具酶 A. 剪切酶类 有目的有选择的把目的片段切开 B. 连接酶类 将目的片段和载体相连 C. 其他工具酶 修饰, 加工等作用 同切酶和同粘酶 同切酶: 识别相同的位点, 但生成不同的末端. 同粘酶: 识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端 连接酶及其对底物的要求: T4 Ligase, Ecoli Ligase 载体及其构成基本要素 能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒, 端粒 方便插入外源片段: 单酶切位点 选择标记: 药物抗性 报告基因: 插入筛选标记 易分离提取 高产率（多拷贝） 强启动子 多宿主 常用载体 质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬粒(phagemid), 病毒，PAC，YAC，BAC 常用宿主 大肠杆菌: 繁殖快, 易培养, 易分离产物 噬菌体: 转化效率高, 易于保存 酵母: 繁殖最快的真核生物, 适于有蛋白质加工的基因表达 如何提高克隆效率? 提高插入片段和载体的比例 尽可能采用粘端连接* 载体脱磷以降低载体自连 插入片段磷酸化 改进转化条件 问题: 有一外源片段用某种酶切,生成了5′ 突出粘性末端　 5′ -GATC, 但是载体上的单酶切位点只能生成下面这几种粘性末端: 5′-CTAG 5′-TCGA 5′-TTAA 应当采用怎样的策略来提高连接效率? 不依赖于内切酶和连接酶的体外重组 位点专一性重组 （依赖于短片段同源序列的重组） 筛选DNA文库 用标记的核酸作为探针 用诱饵质粒筛选表达cDNA文库 探针标记 标记物： 同位素标记：32P 非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等 PCR技术及其应用 应用范围： 检测和诊断（高灵敏度） 基因克隆（eg: 通过部分已知序列扩增未知目标片段 其他常用分子生物学技术 丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE） 脉冲电泳 双向电泳 Southern杂交 northern杂交 western杂交 转基因动植物和基因治疗 转基因动物：医学研究，生物制药 转基因植物：改良品质，提高抗逆能力 基因治疗：治疗药物无法根治的遗传性疾病 反义RNA作用原理 转基因植物实例 基因治疗 利用人工载体携带基因转化人体细胞, 植入遗传病患者体内后, 外源基因表达产生活性产物, 代偿先天缺失或损坏基因的功能, 使得遗传病患者可以脱离日常药物治疗, 健康生活. 1990年美国首次对一名4岁的先天免疫缺陷患者进行基因治疗, 获得成功 血友病B的基因治疗 血友病分为血友病A和血友病B, 分别由凝血因子VIII和凝血因子IX的缺陷引起. 复旦大学薛京伦课题组和第二军医大学合作, 进行血友病B的基因治疗临床实验, 用改造病毒载体携带凝血因子IX基因转化培养细胞后植入患者皮下, 成功提高了患者的凝血力. 采用部分填平法造成2碱基的匹配粘性末端 高效，精确，特别适合大片段分子的重组。 PHAGEMID的结构和工作原理 Lambda噬菌体载体及工作原理 合成cDNA的一般原理 如何产生一群有方向性的cDNA，必要性（表达需要），原理，限制性内切酶对甲基化的敏感性产生对位点的选择性作用 探针的标记 Cosmid结构和工作原理 用标记探针筛选DNA文库的流程 随机引物标记法 酵母双杂交系统的原理，GAL4的两个功能域被分别克隆到2个载体，单独表达时没有相互作用，空间上分离，不能启动下游基因表达 原理： TAQ酶的特点，作用，反应条件对PCR结果的影响，设计引物需注意的地方 TROUBLESHOOT，可能出现的问题和解决方法。 变性 模板DNA 随机6核苷酸引物， dNTP, 某种标记dNTP DNA Pol I 5‘ 随机引物 标记的DNA片段 Synthesize Radioactive PROBE Purified templete Klenow, random primer probe REMOVE REMOVE Inserted DNA coding Protein for detection GAL4-AD lacZ bait DNA Inserted DNA coding Protein for detection GAL4-AD lacZ bait DNA Bait DNA Bait DNA iRNA作用原理 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????