固氮施氏假单胞菌RNA分子伴侣蛋白Hfq与碳代谢抑 制蛋白Crc在碳代谢途径中的协同作用-生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我 一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 始时在1·-Lr名笨且日期: 始时 在1· - Lr 名 笨且 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留 学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅:学校可以公布该论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 (必威体育官网网址的学位论文在解密后应遵守此规定) 签名:料她 导师签名:伴以 日期: 1b b ) 西南科技大学硕士研究生学位论文第 西南科技大学硕士研究生学位论文 第 I页 摘 要 微生物在多种碳源存在的情况下，优先选择优势碳源而抑制非优势碳源的利 用，这种现象称为碳代谢物抑制。在假单胞菌中，全局调控因子 Crc 被认为是参 与碳代谢抑制调控的核心蛋白，可通过与靶标基因的 mRNA 互作进而发挥调控作 用。近年来，有研究认为 RNA 分子伴侣 Hfq 参与了 Crc 与靶标 mRNA 的分子互 作，Hfq 可通过与 mRNA 分子的互作进而调节其稳定性目前关于两种不同的学术 观点仍存在争议，而 Hfq 和 Crc 在固氮菌中的研究尚未见报道。固氮施氏假单胞 菌 A1501 分离自水稻根际，如何高效利用根际环境中复杂的碳源对该菌的根际定 殖及环境适应至关重要，但是该菌中 Crc 与 Hfq 蛋白在碳源利用调控过程中的功 能及其协同作用缺乏分子证据。本研究在实验室已有 hfq 突变株和 crc 突变株基础 上，通过 hfq 和 crc 双突变株的构建，重点分析了 Hfq 和 Crc 在混合碳源利用中的 生理生化表型，初步研究了 Hfq 及 Crc 在碳代谢调控中的作用机制，取得了以下 结果： 1、研究了 Hfq 和 Crc 蛋白在碳代谢途径中的生物学功能。分别测定了 hfq 和 crc 单突变株和双突变株在单一碳源及混合碳源（优势碳源与非优势碳源混合）条 件下的生长能力，结果发现，在优势碳源（乳酸钠和琥珀酸）为单一碳源条件下， 突变株与野生型的生长能力均无显著差异，而在两种非优势碳源（苯甲酸和葡萄 糖）为唯一碳源条件下，crc 和 hfq 单突变株生长能力显著下降，而双突变株基本 不能生长。在优势碳源乳酸钠与非优势碳源苯甲酸混合培养条件下，crc 和 hfq 单 突变株生长能力增强，而双突变株生长能力较弱。以上结果表明，在非优势碳源 存在的情况下（无论单一碳源或混合碳源），crc 和 hfq 双突变株产生的表型变化水 平都显著强于单突变株，暗示两者可能存在功能上的叠加。以苯甲酸代谢为研究 对象，通过实时定量 RT-PCR 分析了苯甲酸存在条件下（单一、混合碳源）苯甲酸 降解关键基因的表达变化，结果表明，与野生型和单突变株相比，crc 和 hfq 双突 变株中苯甲酸代谢基因 benA、benR、benK 表达量显著下调。根据以上结果，推测 在 A1501 菌中，Hfq 和 Crc 在碳源代谢途径中发挥着协同作用。 2、采用原核表达体系表达纯化了 Crc 和 Hfq 蛋白，并通过微量热涌动实验 （MST）检测了 Crc 和 Hfq 蛋白与靶标分子 BenR（苯甲酸降解调控基因）的 mRNA 西南科技大学硕士研究生学位论文第 西南科技大学硕士研究生学位论文 第 II页 的体外互作。结果显示，Hfq 可与苯甲酸降解调控基因 benR 特异性结合。说明 Hfq 参与了以 Crc 为主要调控蛋白的碳代谢抑制途径。 3、 施氏假单胞菌A1501中hfq和crc基因的同时突变并不影响菌株在LB培养 基中的生长。在低氨、微好氧条件下的固氮酶活测定显示hfq和crc基因突变后施氏 假单胞菌A1501的固氮酶活明显下降。并且氮代谢调控基因（nifA、nifK、glnA、 glnK）表达量都发生下调。与此同时hfq和crc基因突变后使A1501丧失趋化能力， 说明Hfq和Crc在A1501的固氮过程中同时发挥重要的功能，从而影响其它代谢途 径。 综上所述，施氏假单胞菌 A1501 调控蛋白 Crc 与 Hfq 在碳代谢抑制调控中存 在协同作用，同时 Crc 与 Hfq 蛋白可能以某种未知的调控方式协同参与了该菌固 氮、逆境胁迫及运动等生理过程。本研究为施氏假单胞菌 A1501 的碳氮代谢调控 网络研究奠定了重要的理论基础。 关键词： 固氮施氏假单胞菌 A1501；Crc；Hfq；协同作用 西南科技大学硕士研究生学位论文第