哈茨木霉cbh1基因的克隆及在酿酒酵母中的表达-生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 Classified Index: Q939.9 U.D.C: 579 Dissertation for the Master’s Degree in Science CLONE OF cbh1 GENE FROM Trichoderma harzianum AND EXPRESSION IN Saccharomyces cerevisiae Candidate： Zhichao Wang Supervisor： Prof. Jinzhu Song Academic Degree Applied for： Master of Science Speciality： Biology Affiliation： School of Life Science and Technology Date of Defence： June, 2014 Degree-Conferring-Institution： Harbin Institute of Technology 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 摘 要 餐厨垃圾是城市生活垃圾的主要成分，餐厨垃圾的主要成分主要包括淀粉 类食物、植物纤维、动物蛋白和脂肪，以及碳水化合物等。而由于餐厨垃圾中 的纤维素的外部被木质部包被且不溶于水的特点，因此，很难将纤维素水解为 小分子单糖等物质，对于纤维素的利用率及降解效率也极低。纤维素酶作为可 将纤维素降解的一类酶，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷 酶。然而由于天然纤维素酶对于纤维素的降解能力低且提取纤维素酶的成本较 高，故利用基因工程技术构建纤维素酶高产菌株的方法应运而生。酵母表面展 示系统作为微生物表面展示技术的一种，可将目的蛋白展示于酵母细胞的表面， 能够独立完成蛋白质的翻译后修饰，作为真核表达系统，具有成熟的蛋白分泌 和表达机制。因此，凭借其明显的优势，取得了广泛的应用。 本研究以实验室保存的哈茨木霉 T88 做为出发菌株，根据 NCBI 数据库中 相关序列设计引物，经 PCR 扩增得到 1484 bp 的纤维素外切葡聚糖酶 cbh1 基因， 经检测，该基因无内含子，将目的基因与质粒载体连接，成功构建重组质粒 pYD1-cbh1，将重组质粒 pYD1-cbh1 转化到酿酒酵母 EBY100 感受态细胞中， 在筛选培养基中培养 3d 左右，得到阳性转化子，最后将阳性转化子接种至半乳 糖培养基中诱导表达 96 h，通过对表面展示目的蛋白的浓度测定及酶活测定， 得到在诱导 48 h 时，表面展示酶的活性最高。 通过对酿酒酵母表面展示的纤维素外切葡聚糖酶的酶学特性研究，结果表 明：反应的最适温度是 50 ℃；最适 pH 值是 5.0，pH 在 4.0～6.0 之间酶活保 持相对稳定；10 min 为最佳的酶与底物反应时间；通过测定金属离子对酿酒酵 母表面展示纤维素外切酶酶活的影响，发现 Ca2+、 Mn2+ 在终浓度 1.0 mM 时对 酶的活性有促进作用，Cu2+、Zn2+ 和 Fe2+ 在终浓度 5.0 mM 时对酶的活性有促 进作用，而 Ca2+、Fe3+ 和 Ag+ 在终浓度 5.0 mM 时对酶的活性有抑制作用；且经 研究发现，表面展示酶的储存稳定性和遗传稳定性良好，对餐厨垃圾中纤维素 的降解具有一定的理论和指导意义。 关键词：餐厨垃圾；哈茨木霉；纤维素外切葡聚糖酶；酵母表面展示系统；酶 活测定 I - Abstract Kitchen waste is the main component of municipal solid waste which includes starch foods, plant fiber, animal protein, fat and other carbohydrate. Due to the cellulose is wrapped by the lignin and the characteristics of insoluble in water, it is hard to degrade cellulose into the small molecular substances such as the monosaccharide, so that the utilization of cellulose and the degration efficiency is very low. Cellulase, which can catalyze the cellulosic degration into glucoses is consist of Exocellobiohydrolase, endoglucanases an