光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸中NADH的生理功能解析-发酵工程专业论文.docxVIP

州州州啼 ，则 州州州啼 ， 则川川川句， 川川吨， 则川肌肉MM mM川00 川川mno mA 州Y 摘要 本论文以一株肉酣酸工业化生产菌株光滑球拟酵母 (Torulopsis glabrata)CCTCC M202019 为模型，从提升 T.glabrata 生产两酣酸效率入芋，借助代谢工程策略与生化工 程方法，综合运用表达谱芯片、定最 PCR (qPCR) 、间位素标记相对和绝对定量技术 (iTRAQ) 、关键酶活性测定和代谢物分析等系统生物学方法，研究胞内NADH 代谢方式， 调控 T. glabrata 碳代谢流、影响基因转录与蛋白质(酶)表达水平以及增强对外界环境适 应性的生理机制。主要研究结果如下 z  1w111 1) 采用生化工程方法调节发酵培养基中综合表征其物理化学特性的氧化还原电位 (ORP)，解析ORP 水平调控胞内 NADH 代谢，进而加快糖酵解速率和改变碳流分布 的生理机制。在 20%溶氧条件下，利用铁氟化何将培养环境的氟化还原电位从 200mV 调高到 400mV 。较高的氧化还原电位激捕了依赖NADH 的膜结合的铁还原酶活性， 从而使胞内 NADH 氧化途径从氧化磷酸化部分转向膜结合的铁还原酶途径，实现 NADH 非产能氧化。该 NADH 氧化策略显著提高了包括己糖激酶、磷酸果糖激酶和 两酣酸激酶在内的糖酵解关键酶基因表达水平及其酶活性，而同时由于胞内 NADH 水平的降低，削弱了依赖 NADH 的甘油和乙醇合成途径。当 ORP 水平为 400mV 时， T.glabrate 的比葡萄糖消耗速率、比两酬酸合成速率和两酬酸产率分别增加 46% 、82% 和 23%; 2) 将肺炎链球菌 (Streptococcωpneumoniae) 编码 NADH 氧化酶基因 nox、英膜组织胞浆 商 (Histoplasmα capsulatum) 的选择性氧化酶基因 AOXl 和施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri) 的亚磷酸脱氧酶基因 PtxD 分别过量表达于 T.glabrata 中，并 借助增强型荧光蛋白的发光特征，确认成功构建了定位于不同亚细胞结构中的 NA旷再生途径。在对数生长中期，过量表达 NADH 氧化酶和选择性氧化酶导致胞 内NADH 浓度分别下降 55%和 45% ，而亚磷酸脱氢酶的过量表达导致NADH 浓度 增加 11%。与对照菌株T.glαbrataCON 相比较 ，T.glabraωNOX 和 T.glαbraωAOX 的两酬酸产最分别增加了 13%、19%，两酣酸产率分别增加了15%、21% ，两酬酸 生产强度分别增加了 22%、29%; 而 T.glabrata PtxD的丙酣酸产最、产率和生产强 度分别降低了 20%、17%和 20%; 3) 借助表达谱芯片、 qPCR、汀RAQ 、关键酶活性测定等系统生物学策略，在基因转录、 蛋白质表达、关键酶活性等层次系统阐释了不同亚细胞结构中 NAD+水平对丙酬酸 合成代谢途径(葡萄糖转运系统、糖酵解途径、磷酸戊糖途径和甘泊合成途径)的影 响。从调控不同亚细胞结构内 NADH 来看，降低胞质和线粒体 NADH 水平: (1)都 显著上调 CAGLOA01782g 转录水平及其编码的己糖转运蛋白表达量，但是敲除 CAGLOA01782g 并不会降低 T. glabrata CON、NOX 和 AOX 糖酵解速率，说明 摘要 CAGLOA01782g 编码的葡萄糖转运蛋白不是控制糖酵解速率的关键因素; (2) 都能 有效诱导糖酵解途径，特别是磷酸果糖激酶基因转录上调及酶活性增加，但是降低 线粒体 NADH 水平能更显著的增强糖酵解活性; (3) 都对磷酸戊糖途径无显著影响。 此外，降低胞质 NADH 导致 3-磷酸甘油脱氢酶基因表达下调及其酶活性降低，但是 降低线粒体 NADH 并没有对甘油途径基因表达水平产生影响:就调控细胞质内 NADH 水平而言，其对磷酸戊糖途径影响较小，而对其它丙酣酸合成相关途径影响 的差异主要体现在，增加胞质内 NADH 水平: (1)对所布检测到的编码己糖转运蛋 白基因转录没有影响; (2) 下调了糖酵解关键酶基因和蛋白表达水年以及降低关键 酶酶活性; (3) 显著上调甘油合成途径中的编码弘磷酸甘油脱氢酶和甘油 L磷酸酶 的基因表达，增强了 L磷酸甘油脱氧酶酶活性: 4) 调控不同亚细胞结构内 NADH 水平对三楼酸 (TCA)循环途径基因转录、蛋白表达量、 酶活性和丁CA 循环中间代谢物浓度均没有显著影响。增加硫肢素的补加量， NADH 调控可以显著的改变丁 CA 循环碳代谢流，表