碱基顺序的化学分析法.pptVIP

M13载体系统的双脱氧链终止法序列测定 单链模板DNA的制备 双脱氧测序反应 序列胶高压电泳及放射自显影 DNA序列的阅读 单链模板DNA 的制备 将待测目的DNA插入到M13载体上的MCS中，通过转染受体菌获得重组克隆的噬菌体。M13感染细胞后并不使细胞裂解，但感染的细胞生长缓慢，并不断释放成熟的噬菌体，一个细胞在噬菌体复制的每一代释放出200左右的噬菌体。在液体培养基培养感染细胞时，噬菌体不断从细胞中释放出来并在培养基内积累。 从单一噬菌斑形成的噬菌体颗粒或从细菌菌落中小规模制备单链M13噬菌体或噬菌粒DNA，常用的方法有PEG法及乙酸沉淀法。 PEG法制备M13实验程序 双脱氧测序反应 利用Klenow片段酶的测序反应 一 引物与模板的退火 Klenow片段酶介导的链延伸-链终止反应 RT反转录酶的介导的链延伸-链终止反应 二根据BRL公司提供程序略加改动 准备工作——配制核苷酸贮存液 引物与模板的退火 链延伸-链终止反应 三 以下根据Boehringer Mannheim公司提供的资料编写 准备工作——配制d/ddNTP混合液 引物-模板退火 链延伸-终止反应 3.5核酸碱基顺序分析中的化学方法 DNA化学顺序方法于1977年由A.M.Mamamx和W.Gilbert第一次报道，因此又称为M＆G法（化学降解法）。这一方法是将模板DNA的一端标记，之后按碱基顺序逐个地将整个大分子断裂，标记的DNA片段的长度或大小与每个碱基的所在位置相对应，当这些反应产物经过变性聚苯稀酰胺凝胶电泳分离后，其代表的DNA顺序便可以从同位素标记的自显影带形上读出。这项技术可以测出距离标记位点250核苷酸以内的DNA序列。经过多年的努力在模板DNA末端标记和特异性化学反应方面都进行了改进，使这一方法成为DNA序列分析的基本方法。 化学降解法测序原理 在M＆G法测序系统中，一个末端标记的DNA片段在4组或5组互为独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。在这几组反应中通过化学裂解形成的放射性标记的分子具有共同起点——放射性标记末端，而其终点不同——发生化学降解的位点。每组混合物中的含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在待测DNA全长片段中的位置。此后，将各组反应产物进行序列胶高压电压分离，再通过放射自显影显示序列结果。 原理示意图 方法成败的关键 一、对特定碱基进行化学修饰 二、经过修饰的碱基从糖环上脱落，DNA主链在修饰碱基5 ’和3 ’磷酸二脂键断裂。 DNA样品的制备待测DNA样品的末端标记单末端标记DNA片段的分离纯化碱基特异化学裂解反应序列胶高压电泳分解读取序列 化学法测序的一般流程 载体的选择 化学法中用的最多的是Messing及其同事构建的pUC系列载体。它们是化学法测序中比较好的载体。 Puc质粒系列图谱 Psp64/图谱 DNA样品的制备 DNA样品必须是来自转化细胞的单菌落，绝对不含有宿主细胞的染色体DNA及其RNA。 1、氯化铯-溴化乙啶梯度平衡离心法纯化质粒DNA。 2、寡核苷酸——从固相支持物上洗脱下的寡核苷酸不具有5’末端磷酸基团。测序前用高压液相柱或电泳技术纯化进行5’末端标记。 DNA样品的末端标记 Klenow片段酶介导的标记反应 1.在一支微量离心管中加入： 具有3 ’凹端的DNA片段 3种dNTP混合液 Klenow片段酶缓冲液 ａ-32P-dATP 2.混合均匀后加入0.5微升Klenow片段酶，混匀后置于20-22 ℃保温30分钟。 3.70 ℃加热10分钟终止反应。 单末端标记DNA片段的分离和纯化 一般采用变性DNA的中性琼脂糖凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行分离。 最常用的洗脱方法是机械洗脱和电洗脱，目前已有许多种商品化电洗脱装置，性能优良回收率高。 双链DNA的解链及两条链的分离回收 双链DNA的变性 1.在一支微量离心管中加入 32P标记的DNA片段; 变性加样溶液 2.混匀后置于90 ℃保温2分钟，迅速放入冰浴冷却。 非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳分离 制备一块适宜浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶 确定