含Hsp70的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5及N蛋白基因的核酸疫苗构建及免疫研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

四川农业大学硕士学位论文 中文摘要 imtlWW川 1I1111111111111111111 J -CSU1236 本试验根据 Genbank 发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)ORF5 基因、 ORF7 基因和结核分校杆菌 Hsp70 基因设计合成特异性引物，以本实验室保存的 PRRSV-SCQ 株提取其总 RNA 为模板， RT-PCR 扩增出 369bp 的目的片段 ORF7A(含终止子)和 ORF币， 井克隆到 pMDI9-T 载体中:以本实验室构建的 pMD18-T-O 盯5 和 pMDI8-T捉叩70 为模 板， PCR 扩增出 516bp 和 1878bp 的目的片段 ORF5 和日sp70，其分别克隆到pMD19-T 上:扩增 PRRSV-SCQ 株 ORF7A 和 ORF7B 基因分别插入 pMD19- 下ORF5 中，得到 T-ORF5-0RF7 A 和丁:ORF5-0RF7日。将两者克隆到 pCI咀ω 上，获得 pCI-ORF5ORF7A 和 pCI-ORF5-0RF7B; 再将 Hsp70 插入 pCIORF5-0RF7B ，构建出童组质粒pCI-ORF5ORF7日-Hsp70 。将pCI-ORF5-0RF7 日-Hsp70 DNA 疫菌免疫健康小白鼠，同时设立 pCI-ORF5-0RF7 A DNA 、pCI-neo DNA 、PRRS 弱毒疫苗、生理盐水 4 个对照组，断尾 采血井检测 ORF5 、ORF7 和 Hsp70 的 mRNA 转录、蛋白表达、细胞因子 IFN-Y 和 IL-4 水平以及丁淋巴细胞亚群变化。结果显示如下: 1、通过质粒的重复测序表明，本研究成功构建了重组质粒 pCI-ORF5-0 盯7A 和 pCI-ORFιORF7 日-Hsp70? 2、真核意组表达质粒pCI-ORF5-0RF7 A 和 pCIOR时-ORF四-Hsp70 分别接种小鼠 14d眉，在小鼠外周血(经 DNase 处理)中均能检测到 ORF5 和 ORF7 基因的 mRNA; 在接种过 pCI-OR时-ORF7B-Hsp70 的小鼠外周lfn.(经 DNase 处理)中可扩增出 Hsp70 基因的 mRNA ，表明囊组DNA 在小鼠体内得到了有效转录。 3、重组质粒pCI-ORF5ο 盯7BHsp70 免疫小鼠后， 14d、21d 、28d、35d 、42d 时， 用 ELISA 试剂盒检测血清中 PRRSV 特异性抗体水平，该组抗体水平高于 pCI-ORF5- ORF7A 组和 PRRS 弱毒疫苗组，其 28d 抗体水平 (OD630 值为 0.875)达到峰值， 42d 抗体 水平(OD630 值为 0.782)有所阻落:极显著大于 pCI-ORF5-0RF7 A 组，显著ω0.05) 大 于 PRRS 弱毒疫苗组。 4、使用ELISA 试剂盒在 35d 时检测 IFN- y 和 IL-4 ，pCI-ORFιORF7 肌Hsp70 组的 IFN- y (196.35pglmL) 和 IL-4(53.27pg/mL) 分泌水平最高:极显著(p 0.01) 大于 pCI-ORF5-0RF7 A 组:显著(p0.05)大于 PRRS 弱毒疫苗组:而 pCI-neo 组和生理盐水 组分泌 IFN-Y 和 IL-4 水平均很低。 5、使用流式细胞仪检测小鼠外周血T 淋巴细胞亚群: pCI-OR时-ORF7B-Hsp70 组 四川农业大学硕士学位论文 四川农业大学硕士学位论文 II II 的小鼠外周血 T 细胞 CD3+水平(78.39%)最高，极显著(p 0.01)大于 pCI-ORF5-0RF7 A 组和 PRRS 弱毒疫苗组; CD矿水平 (51.72%) 同样最高，极显著(p 0.01) 大于 pCI-O盯5-0RF7A 组，显著(p 0.05)大于 PRRS 弱毒疫苗组; CD8+水平(24.66%) 与对照 组相比无明显差异(p 0.05); CD矿/ CD扩比值最高，但与对照组相比差异不显著 ω〉 0.05) 。 本研究所构建的以 Hsp70 为分子佐剂的 PRRSV-ORF5-0RF7 核酸疫苗能够诱导小鼠 产生较好的免疫应答，为 PRRS 新型核酸疫苗的进一步研究提供了参考数据。 关键词: PRRSV; 分子佐剂:重组质粮:核酸疫苗 .， Construction and immunity ofthe recombinant DNA vaccine containing GP5，N protein and Hsp70 genes for porcine reproductive and respiratoηsyndrome Zeng Hui