过量atRA对胎鼠腭间充质细胞增殖的影响 及作用机制-营养与食品卫生专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者： 日期： 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。必威体育官网网址论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者： 日期： 摘要 摘要 摘要 目的 探讨过量全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）小鼠腭间充质细胞增 殖的影响及其作用机制。 方法 取周龄为 10 周左右的 SPF 级 C57BL/6J 近交系小鼠(雌鼠 40 只，雄鼠 20 只)， 于前一天晚 8 时按雌雄比 2:1 进行合笼交配。以次日早晨观察到阴栓阳性的雌鼠 标记为妊娠 0 天(gestation day 0, GD0)，共获得 30 只孕鼠，随机分组后，每组 15 只。在 GD10 时，实验组以一次性灌胃给药的方式给予孕鼠 100mg/kg 的 atRA， 对照组孕鼠灌以等量玉米油。分别取两组 GD13、14、15 和 16 时灌胃时点的胎 鼠标本，利用 HE 染色连续观察胎鼠腭板发育情况。 我们建立 GD13 胎鼠腭突间充质细胞原代培养模型，利用生长状态较好的第 三代胎鼠腭间充质 (mouse embryonic palate mesenchymal, MEPM) 细胞 进行体 外实验，根据 atRA 作用浓度，实验共分为 5 组(0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、 5 μmol/L、10 μmol/L)，并设空白对照组。atRA 作用时间分别为：24h、48h 和 72h。利用台盼蓝染色、MTT 法检测 atRA 对 MEPM 细胞活性的时间-效应和剂 量-效应关系，由此结合 RA 的临床药理特点，选择适宜的时间和浓度，进行后 续的实验。利用 Real-time PCR 检测过量 atRA 对 Smad2、Smad7 mRNA 表达的 影响， Western blot 方法检测过量 atRA 对 MEPM 细胞内蛋白 Smad2、Smda7 和 p-Smad2 蛋白表达的影响。应用统计软件 SPSS17.0 分析本实验结果。检验水准 均为双侧 α=0.05。 结果 HE染色实验结果显示：对照组GD13、14、15和16胎鼠双侧腭板完成上抬、 接触及融合过程；而与对照组相比，实验组 GD13 胎鼠双侧腭板体积较小，且 并未观察到双侧腭板上抬；GD14时，实验组胎鼠双侧腭板未上抬，可观察到发 育明显延迟；GD15时，实验组双侧腭板仍未发生接触，最终在GD16时观察到实 验组胎鼠两侧腭板形成腭裂。 I 台盼蓝染色结果显示，随atRA作用时间及浓度增加细胞拒染率逐渐降低， 提示随atRA作用时间及浓度增加，细胞活性逐渐下降；MTT实验结果显示：atRA 浓度在0.1 -10 μmol/L 范围内，随着培养时间延长，MEPM细胞吸光度值为递减 趋势，MEPM细胞活性随着atRA浓度增加细胞活性逐渐下降，尤其是加药72小 时后，细胞增殖明显受到抑制，并呈一定的剂量效应关系。我们利用SPSS 17.0 分 析得到atRA作用72小时对MEPM细胞的半数抑制浓度为：4.76 μ HYPERLINK /s?wd=mol%2FLamp;tncpramp;fenlei=mv6quAkxTZn0IZRqIHckPjm4nH00T1YLn1I9PjP-Pj6snAmdmvfY0ZwV5Hcvrjm3rH6sPfKWUMw85HfYnjn4nH6sgvPsT6KdThsqpZwYTjCEQLGCpyw9Uz4Bmy-bIi4WUvYETgN-TLwGUv3EPH01nHb1rjn mol/L。实时定量 Real-time PCR结果显示，与对照组比，实验组(5 μmol/L atRA)可促进Smad7 mRNA的表达(P0.05)，而对Smad2 mRNA 表达无影响(P0.05)；Western blot 实验结果显示，与对照组相比，5 μmol/L atRA可下调 p-Smad2蛋白的表达，促 进Sma