固定化酶制备牡蛎ACE抑制肽及抗氧化肽-遗传学专业论文.docxVIP

Classified Index：S917.4 U.D.C：577 Dissertation for the Master Degree in Science THE PREPARATION OF ACE INHIBITORY PEPTIDES AND ANTIOXIDATIVE PEPTIDES FROM OYSTER BY IMMOBILIZED ENZYME Candidate： Yingying Huang Supervisor： Junhu Wang Associate Professor Academic Degree Applied for： Master of Science Speciality： Genetics Affiliation： School of the Marine Science and Technology Date of Defence： June, 2013 Degree-Conferring-Institution： Harbin Institute of Technology 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 摘 要 为了通过食疗的方法预防并治疗高血压及自由基氧化损伤等疾病，满足人 类对健康饮食及医疗安全的要求，提高海洋资源利用率，研究酶法制备海洋生 物活性肽成为解决问题的有效手段之一。牡蛎由于兼具丰富的营养保健及药效 价值，是开发海洋生物活性肽的重要来源，同时固定化酶与切向流超滤膜系统 的结合在操作结构及分离效果方面的优势在工业化生产海洋生物活性肽中具有 广阔的应用空间及发展潜力。 本课题主要探索了固定化酶及切向流超滤膜系统制备牡蛎 ACE 抑制肽及抗 氧化肽的工艺条件，并经凝胶过滤层析及高效液相色谱对活性肽进一步分离纯 化，分析其分子量分布及多肽结构特性，为研究海洋活性肽的制备工艺及构效 关系提供理论支持，同时为固定化酶及超滤膜系统的工业化应用及海洋生物活 性肽产品的产业化提供参考依据。主要研究结果如下： （1）以肽得率及水解度为指标，胰蛋白酶制备 ACE 抑制肽的优化条件为 蛋白浓度 50mg/mL，温度 40℃，pH 8.0，加酶量 5000U/g，酶解时间 8h，ACE 抑制率达到 36%-37%。制备抗氧化肽的最佳条件为温度 45℃，pH 为 7.5，加酶 量 6000U，酶解时间为 7.5h，DPPH 自由基清除率最高达 83.22%，羟基自由基 清除率最高达 95.69%。温度对游离酶制备牡蛎 ACE 抑制肽及抗氧化肽均具有显 著性影响。 （2）探索了固定化载体材料及固定化酶制备工艺，选择制备海藻酸钠及壳 聚糖混合凝胶作为固定化酶的载体，正交试验优化得到共混凝胶包埋吸附法制 备固定化胰蛋白酶的最佳工艺条件为 0.4%戊二醛，4.5%CaCl2，加酶量 1:15，吸 附交联 14h，酶比活力最高达 128.39 U/g，此法制备的固定化酶稳定性、机械强 度及使用效率均有所提高。 （3）优化了固定化酶酶解牡蛎蛋白制备 ACE 抑制肽及抗氧化肽的工艺条 件。在蛋白浓度为 50mg/mL 条件下，得到 ACE 抑制率达 38.82%的牡蛎 ACE 抑 制肽，最佳制备工艺是 pH 为 9.0，温度为 50℃，加酶量为 5g/g 底物，反应时 间为 3.5h，固定化酶可重复使用五次。制备抗氧化肽的最佳工艺条件是 pH 9.0， 温度为 45℃，加酶量为 3g/g 底物，反应时间为 1.5h，DPPH 自由基清除率达到 93.68%，固定化酶可重复使用七次以上，与游离酶酶解效果相比，可以获得活 性更高的 ACE 抑制肽及抗氧化肽。 （4）切向流超滤膜系统有效分离纯化一定分子量的牡蛎 ACE 抑制肽及抗 氧化肽组分，经凝胶层析色谱及高效液相色谱对其分子量分布及疏水性进行分 析鉴定。研究不同截流分子量超滤片段与抗氧化活性、ACE 抑制率及多肽产率 -I- 的关系，ACE 抑制肽及抗氧化肽活性均是不同分子量肽段共同作用的结果，抗 氧化肽活性主要集中在大于 10kDa 及小于 3kDa 的肽段，其中，大于 10kDa 肽 段多肽产率及羟基清除率最高，小于 3kDa 肽段多肽产率其次，而 DPPH 自由基 清除率最高。ACE 抑制肽活性主要集中在小于 1kDa 分子量范围且多肽产率最 高。 通过最佳工艺扩大验证，固定化酶及切向流超滤膜系统可以制备一定分子 量活性较高且性质稳定的牡蛎 ACE 抑制肽及抗氧化肽，为特色海产品的高级精 深加工及海洋活性肽产品的工业化生产提供参考。 关键词：牡蛎蛋白；ACE 抑制肽；抗氧化肽；固定化酶；切向流超滤膜系统 -II- - - PAGE VI- Abstract It has become one of the mo