红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验.docVIP

红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验 流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构，能使一些特定的红细胞发生凝集现象。当红细胞和病毒按适当的比例混合后，由于病毒的作用使红细胞发生凝集，此为凝集现象。含有特异的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象的出现，即抗体与病毒结合后，可以使血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，此为红细胞凝集抑制（HAI）。 微量红细胞凝集抑制试验是目前最常用的一种鉴定流感病毒型/亚型及分析流感病毒HA抗原性变异的试验方法，也可以用于对一般人群抗体水平的检测和疫苗效果的评价等方面。 用于HAI试验的标准参照血清必须及时更新，用于鉴定流感病毒型/亚型应包括当年的国际疫苗株或国内流行代表株的抗血清，可以用羊、鸡、雪貂、兔等实验动物的抗血清；用于抗原分析的抗血清建议包括同一型别和亚型不同毒株免疫的标准参考抗血清，由于用雪貂制备的抗流感病毒血清特异性高，易将不同毒株间抗原性差异显示出来，因此常用免疫雪貂的抗血清进行抗原分析。HAI试验中所用的血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。 （一）生物安全要求 所有有关试验操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定，做好个人防护要求。季节性流感病毒病毒或经完全灭活的高致病性禽流感病毒操作可以在BSL-2实验室里进行，高致病性禽流感病毒的操作在BSL-3级实验室中进行。 （二）实验所用试剂 1．标准参考抗原：以国际疫苗株和国内流行株作为标准参考抗原，新分离的毒株作为待测抗原。 标准参考抗血清：以国际疫苗株和国内流行株制备的抗血清作为标准参考血清。血清要经RDE处理。 （三）其他试剂/材料/仪器 红细胞悬液 PH7.4的PBS缓冲液 RDE（日本生研） 水浴箱（37℃，56℃） 台式离心机 多道可调加样器、单道可调加样器 离心管 96孔微量血凝板（使用豚鼠和人红细胞进行实验须用“U”底板，使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板） 200μL、1000μLTIP头、水槽 表1. 流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较 红细胞 火鸡 豚鼠 人“O”型血 终浓度 0.5 0.5 0.5 孔底部形状 V型 U型 U型 孵育时间 25-30min 45-60min 45-60min 红细胞沉积形状 细胞沉积成点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状 细胞沉积成环状 细胞沉积成环状 （四）流感病毒鉴定和抗原分析步骤 实验前准备 标准参考抗血清的处理 去除血清中的非特异性抑制素 所谓抑制素是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似的物质，它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别和结合。目前所知道的非特异性抑制素，除大白鼠血清中对丙型流感病毒特殊的非特异性抑制素，还有三种：α、β和γ。在HAI试验中，必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净，才能准确地测定出HAI的抗体效价。常用的清除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液（RDE，受体破坏酶的一种）清除法，过碘酸钾清除法等。 RDE处理步骤：用25mL生理盐水稀释RDE；在1体积血清中加入3体积RDE（如0.1mL血清+0.3mLRDE），37℃水浴16-18h；56℃水浴30 min；加入6体积生理盐水（在0.4mL RDE和血清混合物中加入0.6mL生理盐水）。 去除非特异性凝集素 向20体积RDE处理后的血清中加入1体积的纯血球。 完全/彻底混匀，在2-8℃孵育，每15 min重新混匀一次。 1h后，2000转离心5min。吸出血清上清液。 取出一块96孔血凝板，在第一列每孔加入50uLPBS缓冲液,吸出50uL处理好的血清，做2倍稀释，加入50uL红细胞悬液，室温静置30-60min,观察试验结果，如果红细胞沉积，证明血清中非特异性凝集素去除干净（去除非特异性凝集用红细胞类型与下一步试验用红细胞类型一致）。 红细胞悬液配制 A.S液全称为Alsever氏液。配制方法为葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g、去离子水加至100mL，微热溶解，将pH值调到6.1，8磅20min高压灭菌，4℃贮存备用。 将含有红细胞的A.S液，离心5min（火鸡/鸡红细胞1800rpm；人“O”型、豚鼠红细胞2000rpm，不同离心机转速稍有不同），弃上清。 加入等量的PBS缓冲液洗涤，充分混匀，离心5min（转速同上），弃上清。 PBS缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，离心10min（转速同上），弃上清。 吸出适当体积的红细胞，用PBS缓冲液配制成工作浓度为1%红细胞悬液。 流感毒株HA滴度的测定 在微量血凝板的第2~12列加入50μL PBS缓冲液。 在第一列（A