海绵共附生微生物脂肪酶产生菌筛选、培养基优化、酶学性质及基因克隆研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 通过单因素分析和 Plackett-Burman 设计等多种实验设计方法相 4结合，优化了短小芽孢杆菌 B106 产脂肪酶的发酵培养基，确定此细 菌最佳产酶培养基为: tween80 (5.0ml L-1), Mg2+ (17.15 gL?1), PO 3- 4 (2.0 gL?1), yeast extract (5.0 gL?1) 和 maize oil (12.5 ml L-1)，beef extract (5 gL?1) 和 CaCl2 (2.282 gL?1)。起始 pH 值 7.0，5％接种量， 28℃，180rpm，发酵液中的脂肪酶酶活值在 60h 最高可达 86.37U/ml， 细胞干重在 55h 最高为 7.44 gL?1，比发酵基本培养基分别提高 3.54 和 1.31 倍。 对发酵液粗酶性质进行的初步研究发现，短小芽孢杆菌 B106 脂 肪酶的最适酶反应温度为 50℃；最适酶反应 pH 值为 8.0；在 0-150‰ 盐度范围内始终维持在 78%以上的酶活。此外在有机溶剂甲醇、乙醇、 异丙醇、二甲基亚砜（DMSO）中该酶具有较好的耐受性和稳定性， 四种溶剂中对酶反应抑制最强的是异丙醇，在浓度为 10%和 40%的 异丙醇缓冲液中，剩余酶活分别为 82%和 29%；而甲醇在不同浓度 下表现出抑制或促进酶反应的现象，在 10%和 20%的甲醇溶剂中， 残余酶活分别为 139%和 127%，促进酶反应进行，而在 30%和 40% 的甲醇溶剂中，酶活分别为 65%和 33%，抑制酶反应进行；酶在低 浓度的乙醇溶液中抑制作用不明显，在 10%和 20%的乙醇溶液中， 酶活分别为 89%和 86%，而在高浓度时酶反应受到很大抑制，在 40% 的乙醇溶剂中，酶活降为 29%。 通过 PCR 技术从短小芽孢杆菌 B106 (Bacillus pumilus)中扩增出 脂肪酶基因全长。开放读码框为 648bp，编码 215aa。最相似菌为短 小芽孢杆菌 Bacillus pumilus (AAR84668)，相似度达到 98％。氨基酸 一级序列组成中极性氨基酸占 53.02％，疏水氨基酸占 46.98％。同时 对其二级结构进行了预测，α螺旋占 25.58％，β折叠占 23.72％。从 细菌的 PROSITE motif 分析，得出短小芽孢杆菌 B106 脂肪酶中含有 四种潜在的 Pattern：cAMP/cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点（1 个）， 蛋白酶激酶 C 磷酸化位点（2 个），酪蛋白激酶磷酸化位点（1 个）， N 端豆寇酰化位点（7 个）。从蛋白家族结构预测来看，该酶属于 alpha/beta 水解酶家族。系统发育分析表明芽孢杆菌 B106 脂肪酶相似 度较高的菌株多为芽孢杆菌包括短小芽孢杆菌 Bacillus pumilus 以及 地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis，相似度在 90%以上。 关键词：海绵共附生微生物，脂肪酶，16S rDNA，系统发育分析，统计 学培养基优化，酶学性质，基因克隆，生物信息学 SCREENING, OPTIMIZATION OF MEDIUM, PROPERTY AND GENE CLONING OF LIPASE FROM BACTERIA ASSOCIATED WITH MARINE SPONGE ABSTRACT Lipase is used widely in industry. However, the challenges still lie in exploiting novel lipase for research and applied industry. Marine microorganisms have been proved to be an important source for novel enzymes. In this study, the screening of lipase, medium optimization and lipase properties, gene cloning was investigated for bacteria associated with the South China Sea sponge. To our knowledge, there is no data about lipase from bacterial associated with marine sponge. Forty-four bacteria isolated from sponge Stelletta tenuis, Halichondria regosa and