第8章-基因工程原理2.ppt

Principles of Gene Engineering 1 073741824 30 4096 1226 2048 1124 1024 10 4194304 22 512 9 1048576 20 256 8 524228 19 128 7 262114 18 64 6 131072 17 32 5 65536 16 16 4 32768 15 8 3 16384 14 4 2 8192 13 2 1 Principles of Gene Engineering PCR的基本过程分为三步： （1）模板变性：一般在94-95C进行变性3-5分钟。 （2）退火：在合适的温度下，引物和模板结合 （3）引物延伸：在72C条件下，DNA聚合酶合成出新DNA链 Principles of Gene Engineering PCR 过程 Principles of Gene Engineering PCR 反应条件控制要点 （1）引物的设计：引物的质量与PCR的成败有最直接的关系 （2）引物与模板的退火温度： （3）反应缓冲液中的Mg2+浓度； （4）模板：太多会影响反应，最少可到皮克级。 （5）DNA聚合酶：目前均使用耐热的DNA聚合酶 （6）四种dNTP 浓度要一致。 Principles of Gene Engineering PCR技术的发展与应用举例 （1）PCR 技术的新发展：巢式PCR、复合PCR 、RT-PCR、锚定PCR 、反向PCR、不对称PCR、重组PCR等等。 （2）PCR用于特异性探针的合成 （3）用于DNA的测序 （4）产生和分析基因突变 （5）重组PCR将DNA的不同序列连接在一起。 （6）未知序列的PCR扩增（反向PCR ，锅柄PCR） （7）基因组序列比较研究 （8）在临床医学和法医学中的应用 （9）考古研究 Principles of Gene Engineering 美国黄石国家公园的温泉 the hot springs in Yellowstone National Park Principles of Gene Engineering Principles of Gene Engineering PCR还可以用于考古 1991年在Alp发现的目前最古老的木乃伊(Otzi)，5200岁。 Through the PCR technique, this DNA was copied or amplified sufficiently to allow scientists to learn something about his genetic makeup. Principles of Gene Engineering 5.4 其他分离目的基因的方法 人们针对一些基因的特殊性，还设计了许多独特的方法来分离不同的基因。如染色体步行（walking）、染色体着陆（landing）、基因定位、基因表达文库的建立等等。 Principles of Gene Engineering 6 外源基因导入宿主细胞 6.1 外源基因与载体的连接 6.1.1 粘性末端DNA分子之间的连接 6.1.2 平端DNA 分子之间的连接 6.1.3 粘平末端DNA分子之间的连接 6.1.4 影响基因与载体之间连接的因素 6.2 重组分子导入宿主细胞 6.2.1 重组分子导入大肠杆菌 6.2.2 重组分子导入酵母细胞 6.2.3 重组分子导入哺乳动物细胞 Principles of Gene Engineering 6.1 外源基因与载体的连接 经过内切酶作用的目的基因和载体DNA，在连接酶的催化下，两个双链的DNA片段相邻的5‘端磷酸与3’端的羟基之间形成磷酸二酯键的过程，叫做连接（ligation）,连接的结果是外源基因与载体分子连接成为一个新的杂交分子，叫做“重组子”，这个过程也叫做“DNA分子的体外重组”。 DNA 分子之间的连接可以分为几种类型： （1）两个末端均为粘性末端 （2）两个末端均为平端 （3）一个末端为平端，一个末端为粘端 Principles of Gene Engineering 6.1.1 粘性末端DNA分子之间的连接 两个末端为同一内切酶所切割形成：连接较为简单，但是载体自身连接问题严重，转化后长出的菌落中，由载体自身形成的连接占多数。可以通过将5端的磷酸基团去磷酸化而解决。但是外源基因插入载体的方向有两种可能性。 Principles of Gene Engineering