PCR引物设计技巧.ppt

中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences PCR引物设计及软件使用技巧 ← 3’ 5’ Sense primer Antisense primer → 王深浩 引物设计是PCR技术中至关重要的一环 使用不合适的PCR引物容易导致实验失败： a. 非特异性扩增 b. 扩增产物量较少 c. 无扩增产物 2.引物设计的原则 1.引物与模板的序列要紧密互补 2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3.引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配) 引物设计时考虑的因素 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 常用的是18-27bp，太短则特异性降低容易引起错配，太长则结合能量过高，不易结合。 1. 引物长度引物的长度一般为15-30 bp 2. 引物GC含量在40%~60%间，上下游引物GC含量 差异不要太大 a.引物3’端的末位使用碱基A 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基 3. 引物的3’端 b.引物3’端不要出现3个以上的连续相同碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加 c.引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。 5. PCR反应的Tm值（退火温度）.一般在55～70℃ 之间。 （这个温度不同软件的计算差异很大，有时需要实验人员摸索条件） 4.引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列，如增加酶切位点等 6.引物中尽量避免发夹结构和引物二聚体的出现。 Hairpin Dimer 7. 防止引物错误引发（False priming） primer1 primer1 primer2 primer2 目的区域 Primer Premier 5.0的特点 人工操作，精度高 对于复杂结构引物设计可以结合试验条件 对引物做出取舍 总能设计出引物 效率低，不适合大规模设计引物 * * 研究背景