一种新的大丽轮枝菌基因敲除载体的构建.pdfVIP

新疆农业科学2015，52(10)：1878—1883 Sciences XinjiaIlgA鲥cultural doi：lO．6048／j．issn．100l一4330．2015．010．017 一种新的大丽轮枝菌基因敲除载体的构建 毛建才，张婷，高云，宋雯，高峰 (石河子大学农学影新疆兵团绿洲生态农业重点实验室。新疆石河子832000) 摘要：【目的】研究大丽轮枝菌(垤n记溉啪如^f池)致病基因的功能，构建一个便于筛选敲除转化子的高效 基因敲除载体。【方法】通过普通PCR技术扩增得到绿色荧光蛋白基因(GFP)，连接到pMDl8一T载体上，测 序验证，利用限制性内切酶胁以Ⅲ将目的片段切下，连接到敲除载体pRF—Hu2的多克隆位点上。通过电击 转化法将载体转化到农杆菌EHAl05中，利用农杆菌介导法(A7mT)转化到大丽轮枝菌。【结果】成功得到一 种新的携带船P筛选标记的大丽轮枝菌敲除载体，通过G_胛基因的筛选，T—DNA随机插人转化子在荧光显 微镜下呈现绿色，相反敲除转化子在荧光显微镜下不呈现绿色。【结论】构建了一种大丽轮枝菌基因新的高 效敲除载体，利用该载体大大节省了筛选转化子所用的时间，为大丽轮枝菌功能基因的验证提供了技术平台。 关键词：大丽轮枝菌；基因敲除；绿色荧光蛋白基因；农杆菌介导转化 中图分类号：S188+．2 文献标识码：A 文章编号：100l一4330(2015)10一1878—06 段。基因敲除是研究基因功能最具说服力的遗传 O 引言 操作方法之一，它是指对一个结构已知但功能未 【研究意义】大丽轮枝菌(％疗记删Mm如^l池)知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去 是引起棉花黄萎病(讫疗幻姚umwilt)的病原菌，除，然后从整体观察突变体的表型性状，通过分析 可以在多种作物上引起萎焉病害，造成严重的经 突变体表型而明确基因功能的方法¨2|。【本研究 济损失…。由于黄萎病是土传维管束病害，且寄 切人点】大丽轮枝菌基因敲除依赖于其转化体系 主范围广、传播途径多、存活时间长、生理小种变 的成功构建。近年来，农杆菌介导的遗传转化体 异多等，很难利用药剂进行防治。培育和推广抗 系在大丽轮枝菌中已经得到成功应用，极大地提 病品种是一种经济、安全、有效的措施，但多年来， 高了转化效率，为大丽轮枝菌的基因敲除奠定了 基础L9 利用常规育种方式很难得到对棉花黄萎病菌耐病 J。但是在基因敲除过程中存在一个不可 或高抗的品种【2‘4】。所以目前从分子方面研究其 避免的问题，就是转化子的筛选和转化子的鉴定。 致病基因显得尤为重要，通过对轮枝菌分子致病 其中转化子的筛选是一个技术难点。这主要是因 机制的研究，希望能为病害的防治和品种抗病性 为在农杆菌介导的遗传转化过程中，由于T— 的保持提供新的思路和途径。【前人研究进展】 DNA本身的性质，它会随机的插入到基因组的任 目前大丽轮枝菌致病基因的研究进展相对比较缓 何一个位点中，而且T—DNA随机插入的概率要 慢，仅有6个与致病性相关的基因被鉴定，分别是 远远高于同源重组的概率¨引，所以，通常要筛选 协Ⅸl、Ⅷ啊l、附s^伊1、删C1、谢鲫l和 大批量的转化子才能得到基因敲除的转化子。 呦[5。11I。造成大丽轮枝菌功能基因研究缓慢最【拟解决的关键问题】将“荧光标记”技术引入到 根本的原因是缺乏大丽轮枝菌基因功能分析的手 轮枝菌基因敲除体系中。使得T—DNA随机插入 收稿日期：2015—01一05 基金项目：国家自然科学基金项目3“60351) 作者简介：毛建才(1989一)，男，甘肃人，硕士研究生，研究方向为分子植物病理学，