海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究-海洋生物学专业论文.docxVIP

海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 摘要 弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广泛分布于近岸及河口海水、海 洋生物的体表和肠道中，是海水和许多海洋生物的正常或有益菌群的成员。研究 发现，许多海洋弧菌是养殖虾类和鱼类的重要病原菌。溶血素是病原弧菌中分布 最为广泛的毒素之一，能够导致红细胞膜的破裂并伴随着血红蛋白的释放。某 些细菌的溶血作用是由其产生的酶活性引起，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的磷脂酶C和美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的磷脂 酶D，而另一些细菌的溶血素是通过在红细胞膜上的穿孔作用而产生溶血作用。 有时溶血素的穿孔作用不仅仅局限于红细胞，还可以作用于多种其它类型的细 胞，如肥大细胞和嗜中性粒细胞等，通过引起组织损伤而增加其毒性。 尽管弧菌属细菌产生的各种溶血素均具有溶血活性，但它们的核苷酸序列、 预测的氨基酸序列、活性以及作用机理却不尽相同。目前发现5类有代表性的 溶血素家族，即副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的热稳定性直接溶血素 (TDH)、霍乱弧菌(矿cholerae)的El Tor溶血素(HIyA)、副溶血弧菌的热不 稳定性溶血素(TLH)、副溶血弧菌的热稳定性溶血素(6-VPH)以及01型霍 乱弧菌的一种溶血素(HLX)。 本研究使用的57株海洋弧菌包括26株弧菌标准菌株，另有20株哈维氏弧菌， 11株副溶血弧菌是从不同宿主和不同地理环境中分离得到的。从GenBank中获取 所有弧菌的5类溶血素基因序列，分别用ClustaiW(http：／／www．ebi．ae．uldclustalw／) 进行同缘比对。根据保守区域设计5对引物，分别扩增TLH、TDH、HlyA、6-VPH 和HLX溶血素基因片段。使用DIG探针合成试剂盒，分别以哈维氏弧菌(矿 harveyi)VIB 645、副溶血弧菌VIB 611、拟态弧菌(矿mimicus)VIB 298和副溶 血弧菌VIB 462基因组DNA为模板，P．CR合成地高辛标记的溶血素基因TLH、 TDH、HIyA、6．VPH和HLX的部分序列，作为溶血素基因探针，检测这5类溶 血素基因在57株弧菌中的分布。结果显示，在57株弧菌中，含有TDH、niya、 TLH、6．VPH和HLX溶血素基因的菌株分别为2株、2株、49株、3株和30株。分 析表明，TLH溶血素基因广泛分布于弧菌中，尤其在哈维氏弧菌相关菌株(包 括哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌和飘浮弧菌)和费氏弧 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究菌相关菌株(包括费氏弧菌和火神弧菌)中分布较广。HLX溶血素基因在哈维 海洋弧菌中五类溶血素基因分布及其生物学活性研究 菌相关菌株(包括费氏弧菌和火神弧菌)中分布较广。HLX溶血素基因在哈维 氏弧菌和副溶血弧菌中分布较多，在溶藻胶弧菌、辛辛那提弧菌、双氮养弧菌、 霍氏格里蒙菌中也有分布。TDH、HlyA及6．VPH溶血素基因的阳性率均小于 6％，表明TDH、HIyA及6-VPH溶血素基因在弧菌中分布较少。另外，3株哈维 氏弧菌中分别含有2个TLH溶血素基因；一株霍氏格里蒙菌(Grimontiahollisae) 和一株副溶血弧菌中分别含有2个TDH溶血素基因，可见双拷贝溶血素基因在弧 菌中并不罕见。 另外对鳗弧菌(矿anguillarum)VIB 72、河121弧菌(矿aestuarianus)VIB281、 费氏弧菌(Efischeri)VIB 291、河弧菌(Efluvialis)VIB 292、坎贝氏弧菌(F campbellii)VIB 285、飘浮弧菌(矿natriegens)VIB 299和哈维氏弧菌(矿 harveyi)VIB 647的vhlCtlh溶血素基因进行克隆并测序，其氨基酸序列与哈维氏 弧菌的VHH溶血素和副溶血弧菌的TLH溶血素氨基酸序列的相似性分别为 (67～99％)和(6991％)。 用鱼血平板和卵磷脂平板检测57株弧菌的溶血活性和磷脂酶活性。结果表 明，在研究的57株弧菌中，所有含有TLH溶血素基因的弧菌均具有溶血活性； 除费氏弧菌、产气弧菌、火神弧菌和哈维氏弧菌VIB 647外，所有含有TLH溶 血素基因的弧菌也都具有磷脂酶活性；并且大多数弧菌的溶血活性和磷脂酶活性 的强弱与TLH溶血素基因杂交信号的强弱存在正相关性。多数溶血活性和磷脂 酶活性强的弧菌，其与TLH溶血素基因探针的杂交信号也强，但也存在少数例 外情况，如美人鱼发光杆菌、弗尼斯弧菌、塔