实验32 酶联免疫吸附检测法（ELISA）测定植物激素含量.doc

实验17 酶联免疫吸附检测法（ELISA）测定植物激素含量 一、原理?? ??植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶联吸附免疫分析（ELISA），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一种类型。在ELISA中，抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现，常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。酶可直接标记激素分子，称为酶标植物激素，也可标记于第二抗体（识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白），称为酶标二抗。这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型ELISA。A.固相抗体型ELISA：将抗激素的单克隆抗体（Mab）与已吸附于固相载体上的兔抗鼠Ig抗体（RAMIG）结合，然后加入激素标准品或待测样品，使其与固相化的Mab结合， 再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记激素（酶标激素）。通过测定酶标激素的被结合量，可换算出未知样品中激素的数量。B.固相抗原型ELISA：将“激素-蛋白”复合物（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）包被于固相载体，加入待测激素（样品或标准品）和抗IAA多克隆抗体（Pab）反应，进行竞争反应。然后让HRP标记羊抗兔Ig抗体（HRP-GARIG）与结合在固相上的Pab反应，通过测定与固相结合的酶量，换算出未知样品中激素的含量。  ????二、材料、仪器设备及试剂 ?? ??（一）材料：高等植物、真菌、藻类等组织或器官。 ?? ??（二）仪器设备：1. 酶联免疫检测仪；2. 高速冷冻离心机；3. 恒温箱；4. 连续进样器；5. 涡旋仪；6. 96孔微孔板；7. 离心管；8. 研钵或匀浆器；9. 试管。?? ??（三）试剂1. 洗涤缓冲液：0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液（PBS），含0.05％Tween-0；2. RAMIG溶液，或“激素-蛋白”复合物；3. 0.1％封闭蛋白（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）；4. 抗激素Mab，或Pab；5. 激素标准品母液，及参比系列溶液（按双倍或四倍系列稀释）；6. HRP标记激素，或HRP-GARIG；7. 邻苯二胺（OPD）基质液：5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS，用前加入30％H2O212.5μl。??? ?三、实验步骤 ??? ?固相抗体型ELISA。??? ?1. 用方阵法滴定选择各反应物最适工作浓度；??? ?2. 将100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反应板微孔，4℃湿盒，12h；??? ?3. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；?? ??4. 加入100μl抗激素Mab溶液，37℃70min；?? ??5. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；?? ??6. 各孔内依次加入50μl待测样液，每个样品3次重复，15～20℃，20min；? ???7. 加入50μlHRP标记激素，37℃，60min； ????8. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；? ???9. 加入100μlOPD基质液，37℃显色15～20min，加入50μl 3mol/L H2SO4中止反应。用酶联免疫检测仪测定490nm下各孔的A490值，求出每份样品重复孔的平均值。? ???10. 用激素标准母液和参比系列溶液，在同一微孔板上同上法操作。  ????固相抗原型ELISA。? ???1. 用主阵法滴定选择各反应物最适工作浓度；? ???2. 将100μl“激素-蛋白”复合物溶液包被于微孔板，37℃，12h； ????3. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干； ????4. 加入100μl0.1％封闭蛋白溶液封闭，37℃，30min；? ???5. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干； ????6. 各孔同时加入50μl样液和50μl抗激素Pab溶液，以加入正常兔血清溶液的孔（非特异吸附孔）为空白调零，37℃，60min；? ???7. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；??? ?8. 加入100μlHRP-GARIG溶液，37℃，60min；? ???9. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；? ???10. 随后的显色、中止与比色程序同上；11.用激素标准参比系列溶液，在同一微孔板上同上法操作。 ??? ?四、结果计算 ??? ?固相抗体型ELISA。?? ??1. 加入激素母液的的孔（非特异吸附孔）为空白调零，以加入不含激素的PBS的孔为B0孔，以加入激素标准参考系列溶液的各孔为Bi孔。以标准激素摩尔数的常用对数log［激素］为横坐标（X），对应的ln［Bi／（Bo-Bi）］为纵坐标（Y），可得一条Y＝a＋bX直线；?? ?