PCR-SSCP法检测 人肥胖基因的点突变.ppt

PCR-SSCP法检测 人肥胖基因的点突变 聚合酶链式反应 基本原理：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNTPs ，Taq DNA聚合酶，引物，以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环，经过25~35次循环，最终使特异区段的DNA扩增数百万倍，满足分子生物学下游操作。 （polymerase chain reaction, PCR） 单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP) 单链DNA片段呈复杂的空间构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会使其构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以将构象上有差异的分子分离开。称为单链构象多态性分析法。 变性 单链折叠 电泳 SSCP的应用 1. 用于检测与肿瘤发生有关的基因突变 2. 用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染情况、以及病原体传播途径的研究 3. 用于人类遗传性疾病的研究 PCR-SSCP基本操作步骤 其基本过程是: 1.PCR扩增靶DNA; 2.将特异的PCR扩增产物变性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子; 3. 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; 4.最后通过银染显色分析结果。 OB基因 人OB基因全长约20kb，有3个外显子，其编码产物瘦蛋白是一种分泌性蛋白，由167个氨基酸残基组成的。 引物 序列 产物(bp) Primer 1 TGGAGAACCTCCGGGATCT 250 Primer 2 GTTCCTTCCCTTAACGTAGTCC 成 分 体积（μl） 10×Buffer Mg2+ 2.5 2.5 dNTPs（各2.5 mmol/L） 2 引物1 1 引物2 1 Template 3 Taq DNA聚合酶（1 U/μL） 1 dddH2O 12 total 25 1. PCR扩增反应体系 2. 上机，PCR扩增程序设置 预变性 94℃ 5? 变 性 94℃ 30?? 退 火 60℃ 30?? 延 伸 72℃ 30? 补充延伸 72℃ 5? 8℃??????????????? 保存 30个循环 Time : 1h17m 3.聚丙烯酰胺的配置 试剂 非变性聚丙烯胺凝胶 30%丙烯酰胺 4 ml 50×TAE 0.2 ml 甘油 0.6 ml 10%AP 0.1 ml TEMED 0.02 ml H2O 5.08 ml total 10 ml ⑴ 准备好用于灌胶的玻璃板和间隔条，按照说明安装好制胶架，然后按照下表灌胶 ⑵ 倒胶 将胶灌于两槽之间，立即插入梳子（勿使梳齿下有气泡），室温下凝胶后，垂直拔出梳子。用电泳缓冲液冲洗加样孔。 4.PCR产物的处理及上样 PCR产物 10μl 100℃ 5min 上样缓冲液 6 μl 吹打混匀后上样 冰上 2min 5.电泳 1×TAE为电泳缓冲液 ? 160V，电泳2h 10%乙醇固定5min 1%硝酸氧化3min ddH2O洗凝胶1min 0.012mol/L AgNO3溶液，20min 0.28mol/LNaCO3，0.019%甲醛显色 ddH2O洗凝胶1min 10%冰乙酸2min，停止还原反应 ddH2O洗凝胶2min以上 6.银染 PCR-SSCP 结果判断与分析 1 2 3 4 5 6 SSCP注意的事项? ①重复性 影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变，SSCP图谱可保持良好的重复性。 一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时可能只呈现一条SSDNA带，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象。三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。 ②靶DNA序列长度的影响 在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链分子中单个碱基的改变在维持立体构象中所起的作用 较小。而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以 上。 ③电泳电压和温度的影响