分子诊断2015汇总版.doc

Molecular Diagnosis PAGE \* MERGEFORMAT PAGE \* MERGEFORMAT 1 1.分子诊断技术发展 第一阶段 以基因突变位点（导致单基因遗传病）为靶标 核心技术：DNA分子杂交技术 第二阶段 以基因组特异性核酸序列（DNA、RNA）为靶标 核心技术：PCR技术 第三阶段 以基因组特异性核酸序列、蛋白质分子为靶标 核心技术：biochip 技术（高通量） 第四阶段（高灵敏度、高特异性、高通量化、高自动化） 以基因组特异性核酸序列、蛋白质分子、代谢物为靶标 核心技术：二代测序、三代测序、质谱 2.分子诊断技术发展方向 ①分子生物学检验诊断的内容 从传统的DNA检验诊断发展到核酸及其表达产物（mRNA、蛋白质）和代谢产物的多层次水平的检验诊断与过程诊断 ②分子生物学检验诊断的策略 ?从利用分子杂交、PCR等单一技术的检验诊断发展到有机组合多项技术（系统生物学技术链）的联合检验诊断 单分子检验诊断技术 ③分子生物学检验诊断的方法 ?从定性检验诊断 半定量、定量检验诊断 核酸标记技术 定量质谱 ④分子生物学检验诊断的范围 从单基因疾病的检验诊断 到获得性基因病的检验诊断 到复杂性疾病检验诊断 ⑤分子生物学检验诊断的应用 ?从治疗性检验诊断 到疗效评价?到预测性分析评 3.分子诊断技术临床应用 ?单基因病（孟德尔遗传性疾病） 获得性基因病（感染性疾病） ?多基因（多因子）疾病 细菌分型 耐药性的分析 ?疗效监控等 4. 分子诊断技术的标准化 (从临床上 具体每点展开看下) ?临床标本采集、运送和保存的标准化 ?临床标本制备处理和核酸提取方法的标准化 ?检测试剂和方法的标准化 ?检测结果分析的标准化 ?标准物质和质控物的应用 ?临床实验室分子生物学检验诊断技术标准化诸要素间的关系 分子诊断技术的标准化 （从技术上） ?建立分子诊断技术的标准化操作程序 建立分子诊断技术的标准化实验室 ?建立分子诊断技术测定方法的标准化 建立分子诊断项目室内质控和室间评价系统 5.五种单基因遗传病的病因和分子诊断检测方法 一. 血红蛋白病 血红蛋白的构成：2条α珠蛋白（141aa）和2条β珠蛋白（146aa） α珠蛋白基因簇：16Pter -p13.3 β珠蛋白基因簇：11p15.5 镰状细胞贫血症的分子诊断 病因:因β-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，构成镰状血红蛋白(HbS)，取代了正常Hb(HbA)。在氧分压下降时HbS分子间相互作用，成为溶解度很低的螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞（镰变） 对镰刀形细胞贫血的基因诊断方法可有： 1.利用PCR-RFLP的技术进行诊断：基于A→T的变换，改变了限制性内切酶的位点，因此在酶解正常人DNA和患者DNA后再用标记的β珠蛋白基因为探针作Southern杂交时，就会出现不同的DNA条带。限制性内切酶MstⅡ切割的序列是CCTGAGG（其中N是任何一种核苷酸），切割正常DNA产生1.15+0.20 kb β珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时，由于A→T破坏了MstⅡ的位点(CCTGTGG)，便形成1.35kb β珠蛋白的DNA片段； 2.使用PCR-ASO进行诊断：PCR-ASO使用只有几十个核苷酸的探针，检测被检DNA中的同源序列。由于探针比较短，当被检DNA序列与探针不完全互补，甚至只要有一个碱基的差异，杂交分子就不能稳定形成。已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标记，进行Southern Blot 杂交/斑点杂交。 地中海贫血的分子诊断 由于遗传的基因缺陷致使血红蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺如或不足所导致的贫血或病理状态 α 地中海贫血：大多数是由于α珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。 各种表型的α地中海贫血的基因型 静止型α地中海贫血 α—/αα 标准型α地中海贫血— —/αα Hb H病（β4）α—/— — Hb Bart’s（胎儿水肿综合症，γ4）— —/— — α地中海贫血的分子诊断：α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个α Gene时可得到10kb片段。 限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测 β地中海贫血 ：主要是由于基因的点突变，少数为基因缺失。 基因缺失和有些点突变可致β链的生成完全受抑制，称为β0地贫； 有些点突变使β链的生成部分受抑制，则称为β+地贫。 突变在IVS-Ⅱ第654位（nt654）上出现的单碱基取代产生了一个新的GT二核苷酸，联同旁侧序列构成一个新的5′端异常的剪接位点，同时还激