课件：感染性疾病病原体快速诊断.ppt

结核夹层杯技术 原理：通过专用消化灭活液消化组织细胞和粘蛋白等，将结核杆菌裸露出来，并结合高速震荡，使痰标本充分液化而有利于其中的抗酸杆菌沉淀于特制彭氏杯底部的菌膜上，在夹层杯中直接抗酸染色、干燥，并用取片针顶出内底，经封片等步骤后，镜下检测抗酸杆菌。 - * 检测流程示意图 - * 镜下比较 图2. 夹层杯法（新方法）：菌量多，背景清晰，易于观察 图1. 直接涂片法（传统方法）：菌量少，背景不清晰 - * 夹层杯诊断技术的优点 阳性率高 背景清晰，易于观察 易于标准化 检测速度快 生物安全性好 夹层杯诊断 技术的优点 - * 结核夹层杯技术 标本要求： （1）痰液要求新鲜，留取清晨深咳出的第一口痰液，留痰时，患者以清水漱口３次，然后用力咳出气管深处的痰 （2）用氢氧化钠处理完全。 临床应用：用于结核分枝杆菌的初筛 - * 结核感染T细胞检测技术 是以ELISPOT技术 检测结核感染的新方法 ，ELISPOT是近20 年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术，是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一。 - * 原 理 结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8。 结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的活化T淋巴细胞，这些淋巴细胞在体外再次受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌γ-干扰素，通过检测 体外分泌的IFN-γ来诊断是否存在结核感染。 - * 活动性结核与潜伏感染 接触活动性结核病患者 暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除 没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能被发现 X-光/ CT 扫描显示正常 没有抗体应答 诊断困难 传统的结核感染检测只有 TST（PPD） 机体被感染 受机体免疫力抑制 没有临床症状 终身处于感染状态 潜伏感染 有临床症状 具有传染性 结核杆菌可以通过涂片、培养检测出 胸部的 X-光或 CT 扫描显示异常 肺外结核难以诊断(特别是儿童) 活动性结核 5% 5% 再次激活 - * 活动性结核与潜伏感染 新发TB病例来自潜伏性结核感染人群 潜伏性结核感染（hidden epidemic）人群数量巨大 ——“定时炸弹” 若想控制活动性TB，必须先控制潜伏性结核感染 鉴别高危人群 预防性治疗 免疫接种 活动性TB – 每年900万新发病例 仅为冰山一角 Latent TB - “hidden epidemic” - 2 billion people infected - * 结核感染T细胞检测 - * γ-干扰素释放实验 （IGRA，interferon- gamma release assay） 酶联免疫斑点技术 （ELISPOT，Enzyme-Linked ImmunoSpot assay） 结核杆菌特异抗原 早期抗原靶6（ESAT-6） early secreted antigenic target 6 培养滤液蛋白10（CFP 10） culture filtrate protein 10 ） 技 术 背 景 - * 结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。 由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。 基于IGRA原理的检测项目目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中 γ-干扰素释放实验（IGRA） - * 酶联免疫斑点技术（ELISPOT） - * 酶联免疫斑点技术（ELISPOT） 近二十多年来，随着技术改良，ELISPOT 分析技术已经是当世公认的最灵敏的抗原特定T细胞的体外检测技术 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA 技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，灵敏度高。 其技术原理，可一句话概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。 - * 结核杆菌特异抗原 ESAT-6与CFP10抗原 由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白 所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列 绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区 - * 操作步骤 ① ② - * 操作步骤 ⑤ ⑥ ④ ③ 孵育1小时 - * 实 际 效 果 图 阴性结果 阳性结果 空白对照 抗原 A ESAT-6 抗原 B CFP10 阳性对照 （PHA） - * T-SPOT.TB 特点 特异性好，不受卡介苗（BCG）接种和环境分枝