第四章 目的基因的获取.ppt

反转录酶 （3）cDNA的合成 ① cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 mRNA cDNA 3’ 5’ 5’ AAAAAAA TTTTTTT Oligo dT引物 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 cDNA第一链 3’ 5’ 引物 ② 降解mRNA模板 或RNaseH 碱 剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。 cDNA第一链 5’ cDNA第二链合成 DNA聚合酶 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ ③ cDNA第二链合成 ④去掉发卡结构 核酸酶S1 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ 5’ 3’ 这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。 妙用RNaseH 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。 DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。 mRNA cDNA 3’ 5’ 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ mRNA mRNA DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 cDNA第二链 cDNA第一链 3’ 5’ RNaseH DNA ligase 去引物 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。 5.cDNA与载体连接： 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 * * 第四章 目的基因的获取 目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。 第一节 基因组DNA片断化 一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。 酶切 由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。 1. 优点 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！ BamH I BamH I BamH I gene 二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。 （1）限制性内切酶的选用原则 1）4bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 2）6bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 （Sau3A—BamH I） 2. 机械切割法 （1）超声波 超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。 （2）高速搅拌 1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。 1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。 第二节 化学合成目的基因 一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亚磷酸三酯法、 固相合成法 自动化合成法。 ① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH ③ 用酸或碱的脱保护 （1）原理 1. 磷酸二酯法 ② 带保护的单核苷酸连接 保证合成反应的定向进行。 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。 （2）合成过程 下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。 原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。 2. 磷酸三酯法 将第一个核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。 固相磷酸三酯合成法 是目前通用的合成方法。 15 合成的二核苷酸连接处有三个酯键！ 固相磷酸三酯合成过程 固相支持物 结果是全保护的DNA：5’ DMT, 3’固相支持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护 固相 支持物 固相 支持物 C 化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 二、 化学合成DNA片断的组装 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 1. 互补连接法 预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 （2）5’端磷酸化 （1）互