哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆免疫保护作用-微生物学专业论文.docxVIP

㈠㈣2㈣7002矾 ㈠㈣2㈣7002矾＼Y1 9 哈维氏弧茵硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达 及对大菱鲆的免疫保护作用 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 独创声 独创声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 ’他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含未获得 l洼!垫遗直基他霞墓挂剔直明的：奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：y泌 签字日期：如，，年厂月，，日 学位论文版权使用授权书 一本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公 众提供信息服务。(必威体育官网网址的学位论文在解密后适用本授权书) 妣似 ：拶斯 签字日期：沙11年歹月f1日 签字日期：7川年r月I『日 哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大 哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大 菱鲆免疫保护作用 搁要 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性的海洋细菌，广泛分布于海洋 环境及海洋生物，能引起海水鱼类及其它养殖动物发病，是世界上许多国家和地 区养殖对虾和鱼类的致病菌，也是我国海产经济鱼类弧菌病的主要病原菌之一， 给海水养殖业造成了巨大的经济损失。哈维氏弧菌的胞外蛋白酶、磷酯酶、溶血 素、III型分泌系统、密度感应系统等与其致病性密切相关。目前国内对细菌病防 治仍然主要靠化学药物及抗生素，由此带来的环境污染、药物残留及细菌耐药性 现象日益明显。疫苗防治方法由于安全无污染，是未来疾病防治的首选措施。 微生物常遇到环境中较多的活性氧自由基的损害。硫氧还蛋白系统包括硫氧 还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和NADPH，是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫 化物还原酶系统，广泛地存在于真核生物和原核生物中。硫氧还蛋白系统与体内 细胞氧化还原反应、核酸代谢、细胞生长密切相关。其中，硫氧还蛋白还原酶 (thioredoxin reductase，TrxR)是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒 酶。主要功能是催化NADPH将小分子蛋白硫氧还蛋白上的二硫键(．S．S)还原 成(．SH)2的反应，维持Trx的还原型，可以维持细胞自由基产生和清除之间的平 衡，在微生物适应环境及细菌致病性方面发挥重要作用。 本文从致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)SFl基因组中扩增获得含硫氧还蛋 白还原酶基因的1 133 bp目的片段，连接至载体pMDl9-T Simple，测序结果表明， 目的片段含有960 bp的硫氧还蛋白还原酶基因阅读框，编码319个氨基酸残基 的蛋白质。BLAST分析显示氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧 菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列相似性为分别为99％、 98％、96％、94％、92％，该基因被命名为trxR。构建表达质粒pET-28a(+)／trxR后 转化至大肠杆菌但colO BL21(DE3)，用IPTG诱导表达，SDS．PAGE显示重组蛋白 分子量为34 kDa。用Ni琼脂糖亲和柱分离得到纯化的重组蛋白，将该蛋白以 50I_tg／尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆，直接ELISA法检测了1-4周特异性抗体的 效价。结果表明，1_4周内特异性抗体效价持续升高，达到I0927．0。免疫4周后 效价。结果表明，1_4周内特异性抗体效价持续升高，达到I0927．0。免疫4周后 用哈维氏弧菌SFI进行人工感染，对照组的死亡率为100％，免疫组的死亡率为 25％，免疫保护率为75％。表明哈维氏弧菌TrxR蛋白具有良好的免疫原性，可 作为亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。 关键词：哈维氏弧菌；硫氧还蛋白还原酶；克隆；大菱鲆；免疫原性 6 IExpression I Expression and immunogenicity analysis of thioredoxin reductase of Vibrio harveyi SFl on turbot(Scophthalmus Abstract Vibrio harveyi is a halophilic，Gram negative comma-shaped rod bacte