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第八章 DNA 文库的构建 ［本章摘要］ 基因文库指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。按照外源 DNA 片段的来源，可将基因文库分为：基因组 DNA 文库（genomic DNA library）和 cDNA 文库（complementary DNA library）。基因文库构建的基本程序包括：1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大小的 DNA 片段，或提取组织或器官的 mRNA 并反转录成 cDNA ；2、DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体连接形成重组 DNA ；3、重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择。cDNA 第二条链的合成在 cDNA 文库的构建中非常重要，有：自身引导法，置换合成法，引导合成法，引物－衔接头合成法可以合成 cDNA 第二条链。文库构建以后可以通过表型筛选法、杂交筛选和 PCR 筛选、免疫筛选法筛选目标基因。 第一节 ?基因组 DNA 文库的构建 ??? 基因组 DNA 文库：指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。 代表性和随机性?? 代表性是指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。在文库的构建过程中引用了两个策略，一是采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体 DNA ，以保证克隆的随机性，保证每段 DNA 在文库中出现的频率均等；二是提高文库所含基因组 DNA 的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目， Clark 和 Carbon 于 1975 年提出如下的计算公式：??????N=ln（1-p）/ln（1-f）??????N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数??????p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率??????f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组 DNA 大小的比值 一、一、载体的选择?? 构建大片段基因组 DNA 文库使用的载体主要有 λ 噬菌体（λ phage）、粘粒载体（cosmid）、细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes, BAC）、酵母人工染色体 YAC（Yeast Artificial Chromosomes, YACs）、 P1 （Bacteriophage P1）和 PAC 。根据特征，这些载体可以分为两类，一类是基于噬菌体改建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点；另一类经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超过 100kb 以上的外源片段。二、基因组 DNA 文库的构建流程????基因组 DNA 文库的构建流程相对简单，但其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备，尤其是构建插入片段较大的文库如 PAC 、 BAC 和 YAC 文库，其成功的关键都体现在操作的细节上。基因组 DNA 文库的构建程序包含 5 个部分：① 载体的制备；② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取；③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）；④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤ 重组克隆的挑取和保存。图 8-1 为构建 BAC 文库的基本程序，这一程序同样适合 Cosmid 文库、 PAC 文库和 YAC 文库的构建。构建噬菌体文库如 P1 等的程序稍有不同，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。???????????图 8-1 ： BAC 文库的构建流程图1．基因组 DNA 文库的载体制备????载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。2．高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切??? 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的 3～5 倍。实践表明，提取的基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。3．文库的连接转化或包装侵染??? 一般在构建大片段基因组 DNA 文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高