质粒抽提原理及详细操作步骤.docxVIP

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.. 质粒抽提,实验室必备技能之一 质粒 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。 质粒抽提 从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶(主要针对革兰氏阳性细菌)可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和 TritonX-100(一般很少使用)可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后, 细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。 质粒抽提最常用的方法是碱裂解法,它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。当然,碱裂解法也有缺陷:容易导致不可逆的变性。要降低不可逆的变性,就要控制好碱裂解的时间。 碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液 溶液Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0),10 mmol/L EDTA(pH 8.0),在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min,4℃保存。 溶液Ⅱ? ?0.2 mmol/L NaOH(从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释),10 g/L SDS(室温保存)。 溶液Ⅲ 5 mol/L乙酸钾 60.0 mL,冰乙酸 11.5 mL,无菌水28.5 mL,?4℃保存,使用时置于冰浴中。?? 下面介绍一下碱裂解法小提质粒 的具体操作: 01 柱平衡:向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer,12000 rpm离心30-60 s,倒掉收集管中的废液; 注意:吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜,提高质粒的得率;吸附柱平衡后应立即使用,长时间放置会影响其吸附效果。 02 收菌:将过夜培养的菌液用8000 g,2-3 min低温离心,吸弃液体培养基; 注意:高拷贝的质粒,需要5-15 mL的培养菌液;低拷贝的质粒,则需要15-30 mL的培养菌液;残留的液体培养基过多会影响细菌的裂解效果,应尽可能吸干培养基。 03 向离心管中加入250 μl 溶液Ⅰ(加入RNase A),吹匀菌沉淀并将悬液转移至新1.5 mL EP管中; 注意:菌体悬浮不完全会导致裂解不完全,质粒提取量和纯度会降低。 04 向EP管中加入250 μl 溶液Ⅱ(裂解Buffer),温和翻转EP管6-10次,使菌体充分裂解,液体变得澄清浓稠(开盖拉丝); 注意:所用时间不宜超过5 min,以免质粒被破坏;切勿剧烈震荡;液体未变得澄清,则表明裂解不充分,可适当减少菌体量或增大Buffer使用量;若溶液Ⅱ出现浑浊,可37 ℃水浴几分钟,待液体恢复澄清即可使用。 05 向EP管中加入350 μl 溶液Ⅲ,温和翻转EP管6-10次,此时可观察到管内出现白色絮状沉淀,12000 rpm室温离心10 min; 注意:若上清中仍有少量白色絮状物,可再次离心2-3 min直至液体澄清。 06 将离心后上清转移至吸附柱中,12000 rpm离心30-60 s,倒掉收集管中的废液; 07 可选:向吸附柱中加入500 μl Buffer PD(富含蛋白酶),12000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液; 注意:此步对富含内源核酸酶的宿主菌(endA+)是必须的,对于endA-宿主菌可省略。 08 向吸附柱中加入600 μl Wash Buffer(加入无水乙醇),12000 rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液; 09 重复步骤8一次; 10 将吸附柱和收集管放回离心机中,12000 rpm空转离心2 min; 注意:此步骤非常关键,乙醇是否去除干净会影响后续的洗脱效率以及PCR等效果。 11 将吸附柱转移至新的1.5 mL EP管中,拿到超净工作台中开盖鼓风吹5-10 min; 12 向吸附柱膜的中央滴加40-50 μl预热Elution Buffer或者DD水,关盖静置3-5 min,12000 rpm离心2 min; 注意:洗脱Buffer预热后效果更好;可以根据质粒的拷贝数、宿主菌等因素调整洗脱Buffer的添加量。 13 离心后将EP管内的液体重新滴加至吸附柱膜上,12000 rpm离心1 min; 14 做好标记,取2 μl质粒跑1%琼脂糖凝胶电泳检测验证; 15 提取出的质粒-20℃保存。 抽提质

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