3-第三章免疫原和抗血清的制备技术.ppt

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第三章 免疫原和抗血清的制备 郑州大学医学检验系 秦东春 第一节 免疫原的制备 免疫原——是能诱导机体免疫系统产生特异性抗体和致敏淋巴细胞的抗原。 一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、人工抗原的制备 一、颗粒性免疫原的制备 天然的颗粒性免疫原主要是指人、动物或寄生虫的细胞以及细菌抗原等,制备方法相对较简单。 绵羊红细胞的制备 细菌免疫原的制备 1.绵羊红细胞的制备 绵羊红细胞是制备溶血素的免疫原,制备方法是采集健康绵羊的静脉血,立即注入无菌带有玻璃珠的三角烧瓶内,充分摇动15~20min,以除去纤维蛋白,即得抗凝绵羊全血。免疫动物前,取适量抗凝血于离心管中,以无菌生理盐水洗涤细胞3次(每次2000 rpm离心10min),然后取压积红细胞,稀释成106/ml浓度的细胞悬液,即可应用。 2.细菌免疫原的制备 选用经鉴定合格的标准菌株,接种于固体或液体培养基,置温箱37℃培养24h增菌后处理。菌体抗原需要100℃水浴2~2.5h杀菌并破坏鞭毛抗原后应用;而鞭毛抗原要用有动力的菌株,菌液用0.3%~0.5%甲醛处理;细菌毒素抗原则应在杀菌后再加入0.5%~1%氯化钙溶液方可使用。有些寄生虫卵也可制成抗原悬液供免疫用。 二、可溶性抗原的制备和纯化 (一)组织和细胞可溶性抗原的粗提 (二)可溶性抗原的提取和纯化 (三)免疫球蛋白片断的制备 (一)组织和细胞抗原的粗提 (1)组织匀浆的制备 (2)细胞的破碎 — 反复冻融法 — 冷热交替法 — 超声破碎法 — 自溶法 — 溶菌酶处理法 — 表面活性剂处理法 (二)可溶性抗原的提取纯化 1.超速离心法   2.选择性沉淀法 3. 层析法 4.电泳法 1.超速离心和梯度密度离心法 超速离心法 — 差速离心:低速与高速交替进行 — 密度梯度离心:属区带分离法,通过梯度密度来维持重力的稳定性 目前,仅用于少部分大分子抗原,如IgM、C1q、甲状腺球蛋白等,以及一些比重较轻的抗原物质如载脂蛋白A、B等的分离纯化 2.选择性沉淀法 (1)核酸沉淀剂法 (2)盐析沉淀法 (3)有机溶剂沉淀法 (4)聚合物沉淀法 4. 层析法 (1)凝胶层析法:有名分子筛层析,是利用微孔凝胶将不同分子量的成分分离 (2)离子交换层析:是利用一些带离子基团的纤维素或凝胶,吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原,将蛋白质抗原按带电荷不同或量的差异分成不同的组分 (3)亲和层析法:利用生物分子之间专一亲合力的特异性和可逆性分离技术。 (三)免疫球蛋白片断的制备 1.分离非共价键 2.分离共价键 3. 溴化氰裂解法 4. 酶裂解法 1.分离非共价鍵   肽链亚单位之间常为非共价键的结合,如氢键、疏水鍵及静电引力等。这些键结合力较弱,可经酸、碱、胍或脲等将其断开制备片段。 2.分离共价鍵   二硫键是连接免疫球蛋白的共价键,解离肽链间的二硫键可将轻链与重链分开。 3.溴化氰裂解法   溴化氰通过与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应,生成溴化亚氨内酯。后者与水反应,将肽链断裂。 4.酶裂解法   酶解法专一性较好,不良反应少。不同的片段可用不同的酶进行裂解。如木瓜酶可将IgG 裂解成为两个Fab 和一个Fc 片段,胃蛋白酶可将 IgG 裂解成为一个F(ab’)2片段和几个小肽段,胰蛋白酶则将IgG裂解成不规则的肽链。 (四) 纯化抗原的鉴定 常用的方法 纯度测定用聚丙烯酰胺凝胶电泳法、结晶法 蛋白质含量用双缩脲法、紫外光吸收法 分子量测定免疫电泳法 免疫活性用免疫双扩散法 …… 三、人工抗原的制备 人工抗原是指经过人工修饰的半抗原性免疫原,例如多糖、多肽、甾体激素、脂肪胺、类脂质、核酸以及化学物质等。 半抗原不能直接用作免疫原,只有把这些半抗原与蛋白质等大分子物质结合后,才能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。 用于偶联半抗原的大分子物质称为载体。 三、人工抗原的制备 人工结合抗原的制备 人工合成抗原的制备 基因工程抗原的制备 (一)人工结合抗原的制备 1. 载体的选择 蛋白质类:白蛋白 多肽聚合物 :多聚赖氨酸 大分子聚合物 :羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 2.半抗原与载体的连接 带有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原,可直接与载体连接。 带有羟基、醛基、酮基的半抗原,如糖、多糖、醇、酚、核苷以及甾族激素等,不能直接与载体连接,需要用化学方法改造成羧基后才能与载体连接。 芳香族半抗原由于环上带有羧基,它邻位上的氢很活泼,极易取代。 3.半抗原性免疫原的鉴定 半抗原与载体结合的数目与免疫原性相关。一般认为至少要20个以上的半抗原分子

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