流式检测细胞内钙离子.doc

用Furo-3/AM检测细胞内钙离子浓度 FSC forward scatter 480nm SSC side scatter 480nm FL1 515-545nm 绿色 FL2 564-606nm 橙色 FL3 650- 红色 1, 实验目的： 检测不同细胞株中细胞质内钙离子浓度的差异，以检测钙离子浓度对癌细胞的迁移性的影响。 检测迁移性不同的FBJ-LL-H于S1-H 两株细胞中细胞内钙离子浓度的差异。 检测间质作用因子Stim1对细胞内钙离子浓度的影响 包括对照组细胞，Stim1表达的几株单克隆细胞 观察细胞ER钙离子释放之后的钙离子内流 2, 样品处理： 储备液配制 F-127 5mg + 25uL DMSO 终浓度 20% 0.05mg Fluo-3/AM +22uL DMSO F127与Fluo-3/AM 以体积比1比1混合 终浓度为 2 2. 消化细胞 3*10e6/mL-1*10e7/mL 细胞混悬液加入Fluo-3/AM，使之终浓度为4 ?M 3. 避光37℃ 4. PBS(-)清洗2遍 5. 用PBS(-)重悬细胞，将浓度定为1*10e6/mL 6. 当用毒胡萝卜素Thapsigargin（TG）排空细胞内质网钙池钙离子时, 用终浓度为3 ?M的TG 孵育15min， 上样20 s后加入钙离子使其终浓度为1 ?M观察钙离子内流 7, 为观察细胞在加入TG之后胞内钙离子的变化，将未经TG处理的细胞上样20s后加入TG观察钙离子浓度变化，正常情况下TG加入后因为钙池钙离子的释放胞内钙离子浓度会有一个上升的过程，随后因为钙泵失效，钙离子会逐渐降低。 流式细胞仪 Coulter图·横轴 时间 time 纵轴 荧光强度（FL1） 取400uL混悬液，（40-秒 baseline monitoring？）上样持续检测1-3min 激发光波长 488nm 发射波长 530nm 数据处理 CellQuest software 实验原理：Fluo-3-Am进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶的Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。 参考文献中的检测方法： CCL19和CCL21能激活钙内流，细胞内高表达当CCR7变异形式MT1或者DNY时，钙离子内流被阻止。用钙离子载体ionmycin作为阳性对照。 样品处理 Furo-3/AM储备液配成4mM，最终以1.5uL/mL加入10e6/mL的细胞混悬液中，37℃ HEPEs buffer 260.3 mSDF-154 不含a螺旋尾巴的mSDF变异，细胞内加入mSDF多肽能引起钙离子内流，而不含a螺旋的mSDF变异能阻止其功能。 实验方法： 5*10e9/L 细胞中加入Furo-3/AM 终浓度4uM， 室温避光孵育45min，用不含酚红RPMI培养基，加入SDFWT或SDFmt，孵育15min后上样检测。 3．mSDF 含a螺旋于不含a螺旋引起不同的钙离子内流 样品处理; 10e7 细胞悬浮于钙离子分析缓冲液中，加入fluo-3/am使其终浓度为4uM，室温孵育45min，用缓冲液清洗3次，重悬于缓冲液中暗室放置备用。每个样品做一个40s的基准线调试（basement monitoring？）片刻后快速加入SDF-WT和SDFmt，检测钙离子浓度。