蛋白质结构的研究方法.ppt

12 蛋白质结构的研究方法 蛋白质的结构分级 12.1 一级结构的测定 Edman降解法 质谱法 由DNA序列推导蛋白质序列 Edman降解法 蛋白质测序技术最具有意义的发展是瑞典化学家Edman发展的以他名字命名的蛋白质N-端测序方法——Edman降解法。 Edman降解进行多肽序列分析是一个循环式的化学反应过程，如左图所示 循环过程包括三个主要的化学步骤 偶联 裂解 转化 偶联试剂——异硫氰酸苯酯即Edman试剂 多肽链的自由α-氨基与耦联试剂PITC（异硫氰酸苯酯）反应后，与紧邻的第二个残基的结合力大大减弱，易于断裂。 无水强酸如TFA（三氟乙酸）使第一个残基环化，从而使该残基从肽链中释放出来，生成ATZ氨基酸（2-苯胺基-噻唑啉酮衍生物）。紧挨着的第二个氨基酸残基暴露出自由的α-氨基，又可与PITC发生偶联反应，如此进行降解循环。 ATZ氨基酸在三氟乙酸水溶液（25%）中可转化为稳定的PTH-氨基酸（乙内酰苯硫脲衍生物）。 最后对PTH-氨基酸由高效液相层析进行鉴定 据此原理设计出来的氨基酸自动序列仪一次可测出60-70个氨基酸残基组成的肽。 局限性在于不能对环形肽链和N端封闭的肽进行测序，也不能测知某种被修饰的氨基酸。 质谱法 MALDI-MS（基质辅助的激光解析离子化质谱）可通过分析待测离子在飞行管中的飞行时间来测定其质量。分子量超过300ka的分子现已可以用MALDI-MS成功测定。实际可能测量的分子量范围几乎是无限的。 蛋白质固体样本无介质辅助（A）与有介质辅助（B）的镭射脱附过程示意图 MALDI质谱与Edman化学降解相结合，即Ladder测序法。在Edman化学降解中用5%异氰酸苯酯作为末端反应剂与整条肽链形成苯氨甲酰衍生物，而95%仍像往常一样在用三氟乙酸解离后与异硫氰酸苯酯反应以形成缩短了一个氨基酸的肽链，在剩下的降解多肽上连续运用Edman降解循环，最终苯氨甲酰化多肽的混合物通过MALDI-MS一步完成。 另一种将质谱分析（尤其是MALDI-MS）与Edman化学降解偶联起来测定未知蛋白序列的方法是，以1pmol蛋白为起始量，其在酶解或化学裂解下的时间历程用MS来进行监测。消化后用HPLC将肽分离，再用MS和氨基酸分析进行测定，接下来再使用Edman降解。肽分子量的测定结果可用于估计所需进行的循环次数并确认测序结果，修饰过的氨基酸也可测定出来，进而把肽的分子量相加再与完整蛋白的分子量相比较，可把对应于完整序列的肽挑选出来进行测序。到此，大部分序列均被测定。 需求样品量少，速度快 N末端封闭的情况可以通过氨基酸分析与质谱测定的结果进行比较来鉴定 价格昂贵 缺点：对于测定转译后加工所导致的氨基酸残基的修饰无法检测。 12.2 二级结构的测定 圆二色光谱法（CD） 傅立叶红外光谱法（FTIR） 圆二色光谱法（CD） 原理 当一束平面偏振光通过具有手性的介质时，由于该介质对左右旋圆偏振光的折射率不同，使得它们通过介质的速率也不同，因此叠加产生的平面偏振光的偏振方向将会改变，产生旋光性；同时，由于手性介质对左右旋圆偏振光的摩尔吸光率（εl(λ)，εr(λ)）不同，产生一个差值Δε(λ) =εl(λ)–εr(λ)，使得左右旋圆偏振光通过介质后振幅也将不同，这样两者叠加而形成椭圆偏振光，如右图所示。 蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子，主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫键，另外，有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性有影响。 蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的CD光谱分为三个波长范围 1）250nm以下的远紫外光谱区，圆二色性主要由肽键的n→π*电子跃迁引起； 2）250～300nm的近紫外光谱区，主要由侧链芳香基团的π→π*电子跃迁引起； 3）300～700nm的紫外-可见光光谱区，主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起。 相应于蛋白质CD产生的机理，远紫外CD主要应用于蛋白质二级结构的解析，近紫外CD主要揭示蛋白质的三级结构信息，紫外-可见光CD主要用于辅基的偶合分析。 肽键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外CD谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息，从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。 α-螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带，在222和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；β-折