第四章 酶的提取与分离纯化.ppt

膜分离 加压膜分离 微滤 超滤 反渗透 电场膜分离 电渗析 离子交换膜电渗析 扩散膜分离 透析 根据膜材料和不同进料液的特性，商品应用的超滤器通常采取如下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。 四种常用膜分离技术的基本特征 层析方法 分离依据 吸附层析 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 分配层析 利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离 离子交换层析 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的 凝胶层析 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离 亲和层析 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 层析聚焦 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 溶剂洗脱法 置换洗脱法 前缘洗脱法 吸附层析 纸上层析 分配薄层层析 分配气相层析 3、凝胶过滤 常见的凝胶过滤介质有：Sephadex G系列、Bio-Gel AP系列和Sepharose等。 介质上有许多微孔 小分子酶进入微孔内，因此滞留时间长 大分子酶不能进入微孔，而直接流出 三、根据酶分子电荷性质的分离方法 离子交换柱层析 根据被分离物质与分离介质之间异种电荷的静电吸引力不同而进行物质分离的。 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当携带阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。 当携带阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素-O-CH2-COO-），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 交换剂 名 称（纤维素） 作 用 基 团 特 点 阴离子 交换剂 二乙氨基乙基 DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H 最常用在pH8.6以下 三乙氨基乙基 DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H 氨乙基 AE+-O-C2 H4-N H2 胍乙基 强碱性、极高pH仍有效 阳离子 交换剂 羧甲基 CM—-O-CH2-COO— 最常用在pH4以上 磷酸 P－-O- P O2－ 用于低pH 磺甲基 SM－-O-CH2-SO3－ 磺丙基 SP－-O-C3H6-SO3－ 强酸性用于极低pH 常见的离子交换介质 2、电泳 在电场中，带电分子由于电荷性质和带点荷多少的不同，向两极泳动的方向和速度也不同而被分离。 电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为： 纸电泳 薄层电泳 薄膜电泳 凝胶电泳 自由电泳 等电聚焦电泳 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。 3、等点聚焦 在一个pH值梯度电场中，酶分子泳动到其等电点的位置后，因不带电而停止运动，从而被分离。 4、层析聚焦 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为什么能分离分子量不同大小的酶分子？ 四、根据酶分子的专一性结合的方法 亲和层析技术 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使酶分子分离纯化。 利用蛋白质与其配体（ligand）之间的相互作用，如抗原与抗体、酶与底物、激素与受体、细胞因子与受体等蛋白质与配体之间发生特异性结合，而这种结合又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为： 共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析 五、萃取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。 按照两相的组成不同，萃取可以分为： 有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取 六、酶的组合分离纯化策略 Resolution（分辨率） Speed（速度） Capacity（容量） Recovery（回收率） 设计分离纯化工艺的基本要求 本章 目录 第四节 酶纯度的评价 一、 酶纯度的检验 电泳法