基因诊断与产前诊断中常用的分子生物学技术.ppt

基因诊断与产前诊断中常用的分子生物学技术 张淑杰 Commonly used Techniques PCR 聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA测序 MLPA 基因芯片 PCR 实验原理 实验步骤 PCR实验原理： PCR (Polymerase chain reaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 PCR实验步骤： 变性（Denaturation） 将待扩增DNA模板加热，一般变性温度为95℃，双链DNA变性成为单链DNA。 退火（Anealing） 两条引物分别与两条DNA的两翼序列特异性结合——复性。退火温度（Tm）与引物序列的碱基组成、长度相关。 延伸 ( Extention) 在适合的条件下，由Taq(或其他)DNA聚合酶催化引导DNA合成，即引物的延伸。延伸的温度一般是72℃， 这种热变性—复性—延伸的过程就是一个PCR循环。 目的片段的指数扩增 PCR反应体系（终体积20~100ul）： 10×PCR缓冲液 1/10体积 2mmol/L dNTP 1/10体积 引物 各10~50pmol DNA模板 10~20拷贝 Taq DNA聚合酶 0.2~2.5U ddH2O 补至终体积 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 实验原理 主要试剂 实验步骤 实验原理： 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED)作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。当DNA分子进入凝胶，在电场下进行泳动时，可根据各自迁移率的不同而得以分离 。 分为变性胶与非变性胶两种，区别在于前者中含有一定浓度的变性剂（尿素）。非变性胶可用于双链DNA分子的分离与纯化，变性胶可用于单链DNA分子的分离与纯化。由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可消除DNA分子不同构象对迁移率的影响，常用于进行遗传病家系的单体型分析。 变性胶与非变性胶 非变性胶用于双链DNA分子的分离与纯化，双链DNA分子在非变性胶中的迁移率与其大小的常用对数值成反比。即越小跑的越快。但其迁移率也受其碱基组成和序列的影响。 变性胶可用于单链DNA分子的分离与纯化。由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可消除DNA分子不同构象对迁移率的影响，即DNA在胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。常用于进行遗传病家系的单体型分析。 主要试剂： 30%丙烯酰胺： 丙烯酰胺 29g N,N’-亚甲双丙烯酰胺 1g（非变性胶液） 加去离子水至100ml 室温避光保存 10%过硫酰铵（APS）： 过硫酰铵 1g 加去离子水至10ml 4℃避光保存 TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺） 4℃避光保存 10×TBE： Tris碱 86.4g 硼酸 55g EDTA（粉末） 5.96g 加去离子水至800ml 高压蒸气灭菌，室温保存 8%丙烯酰胺（含50%尿素）： 丙烯酰胺 38g N,N’-亚甲双丙烯酰胺 2g（变性胶液） 10×TBE 25ml 尿素 250g 加去离子水至500ml室温避光保存 固定液： 无水乙醇 50ml 冰醋酸 2.5ml 加一蒸水至 500ml 染色液： AgNO3 1.2g 加一蒸水至 500ml 显色液： NaOH