急性大鼠脊髓损伤的蛋白组学初步研究-临床医学专业论文.docx

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 本论文属于 必威体育官网网址 ，在 年解密后适用本授权书。 不必威体育官网网址 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医 天津医科大学硕士学位论文 【目的】 中文摘要 通过比较裂解液法、TCA-丙酮法和酚抽提取法提取大鼠脊髓蛋白的效率， 选择最适合的大鼠脊髓蛋白提取方法；研究大鼠急性脊髓损伤前后差异表达的 蛋白质，分析这些蛋白质生物学功能，为更加深入的了解脊髓损伤后复杂的病 生理过程提供理论依据。 【材料和方法】 本实验提取正常雌性 Wistar 大鼠 T10 前后 1cm 的脊髓组织，分别采用裂解 液提取法、TCA-丙酮提取法和酚抽提取法提取脊髓蛋白，通过比较 Bradford 法 测量蛋白质的浓度，SDS电泳和双向电泳分析提取蛋白的种类和数量，选 择适合大鼠脊髓蛋白提取的最佳方案。 成年雌性大鼠 9 只，随机分成 3 组，每组 3 只。对照组不进行脊髓打击， 仅采用同等剂量进行麻醉，椎板切除后直接取材。实验组采用 IMPACTOR MODEL-Ⅱ打击器建立 T10 脊髓损伤模型（打击力度为 10g×25mm），根据取材 时间的不同分成 3h 组和 8h 组。采用已经建立的大鼠脊髓蛋白提取方案提取蛋 白，通过双向电泳技术分离各组提取的蛋白；采用 PDQuest 软件分析和比较对 照组和实验组 的胶图，寻找 上调或者下调 差异表达 的 蛋白 ； 采用 MALDI-TOF/TOF 对这些蛋白质进行肽质量指纹图谱和二级质谱鉴定；通过 NCBI 和 UniProtKB 数据库对这些蛋白进行亚细胞定位和功能注解；STRING 软 件对差异蛋白进行通路分析。 根据已建立的大鼠脊髓蛋白提取方案提取对照组，3h 组和 8h 组蛋白质，通 过 Western Blot 技术对已鉴定的关键差异蛋白进行验证。 【结果】 1. 与裂解液法和酚抽提取法相比，TCA-丙酮提取法提取蛋白在 SDS电泳上有更多清晰的条带，在双向电泳上有这更多的蛋白斑点，所以本 实验采用 TCA-丙酮提取法为最佳大鼠脊髓蛋白提取方法。 2. 实验组和对照组相比，共有 30 个差异表达的蛋白。包括 9 个代谢相关 蛋白，6 个氧化应激蛋白，5 个神经纤维束蛋白，3 个骨架蛋白，3 个能 量相关酶，1 个细胞转导蛋白，3 个其它。其中 11 个上调，19 个下调。 3. GFAP 蛋白在损伤后 3h 表达明显下降，8h 表达量开始回升，与双向电泳 I 的实验结果相符。 结论 本研究发现 TCA-丙酮蛋白提取法最适合大鼠脊髓蛋白提取，应用蛋白组学 技术筛选急性大鼠脊髓损伤前后的蛋白，绘制差异表达的蛋白谱，寻找潜在的 与脊髓损伤相关的特异分子标志物和探索脊髓损伤后复杂级联病生理机制，为 将来进一步脊髓损伤的治疗提供可靠的实验依据。 关键词：脊髓损伤 蛋白提取 蛋白组学 wistar 大鼠 GFAP II Abstract Objective We identified an efficient protocol for extracting protein from rat spinal cord for 2-DE，among phenol, TCA-A and lysis. To explore the special proteins that were significant regulated after acute spinal cord injury in rat. Understanding the subcellular localization and function of these proteins, may help explore complex molecular cascades underlying the progressive pathologic changes in spinal cord injury. Material and method For each n